南亚实蝇成虫肠道微生物分子多样性分析及引诱效果

发布时间：2017-06-07 22:04

  本文关键词：南亚实蝇成虫肠道微生物分子多样性分析及引诱效果，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：南亚实蝇(Bactrocera tau)是一种重要的世界性检疫害虫,其食性杂,寄主广,繁殖力强,防治困难,每年给果蔬业及其对外贸易造成巨大的经济损失。本文通过16S rDNA V3-V4高变区的高通量测序技术,分析了南亚实蝇雌、雄成虫不同发育阶段肠道内的细菌多样性及群落结构组成。在此基础上运用传统微生物分离和16S rDNA(V6-V8)高变区的Sanger测序相结合的方法,分离、鉴定了性成熟的雌、雄南亚实蝇成虫肠道内的可培养细菌并研究了肠道细菌对寄主成虫的引诱效果。最终为探讨南亚实蝇肠道细菌对其生理功能的影响和利用微生物防治此类害虫提供新的思路和科学依据。主要研究结果如下：在门的分类水平上,南亚实蝇羽化未取食雌性成虫肠道内微生物菌群分属于10个门,分别是变形菌门、厚壁杆菌门、拟杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、衣原体门、Candidatus_Saccharibacteria、梭杆菌门和浮游菌门；羽化未取食雄性成虫肠道内微生物菌群分属于11个门,分别是拟杆菌门、厚壁杆菌门、放线菌门、变形菌门、芽单胞菌门、Candidatus_Saccharibacteria、酸杆菌门、衣原体门、脱铁杆菌门、梭杆菌门和浮游菌门；10日龄雌性成虫肠道内细菌菌群分属于4个门,分别为变形菌门、拟杆菌门、厚壁杆菌门和放线菌门；10日龄雄性成虫、性成熟雌性成虫和性成熟雄性成虫肠道内细菌均分属于3个门,分别是变形菌门、拟杆菌门和厚壁杆菌门,羽化未取食雌、雄性成虫肠道内细菌较其余多样性高,但所有样本的肠道优势细菌类群均为拟杆菌门、变形菌门和厚壁菌门。在纲的分类水平上,南亚实蝇羽化未取食雌性肠道内细菌的优势菌纲是γ变形菌纲；羽化未取食雄性肠道内细菌的优势菌纲为芽孢杆菌纲、γ变形菌纲、黄杆菌纲和拟杆菌纲；拟杆菌纲是10日龄雌、雄成虫肠道细菌的优势菌纲,γ变形菌纲次之；性成熟的雌、雄成虫肠道细菌优势菌纲为拟杆菌纲和γ变形菌纲。在目的分类水平上,南亚实蝇羽化未取食雌性肠道内生细菌主要是肠杆菌目、拟杆菌目和弧菌目等；羽化未取食雄性肠道内生菌在肠杆菌目、拟杆菌目、Orbales、乳杆菌目、黄杆菌目、鞘脂杆菌目、假单胞目、芽孢杆菌目、伯克氏菌目、放线菌目、黄单孢菌目和梭菌目等中均有分布；10日龄雌性肠道内生菌的优势菌目是肠杆菌目和拟杆菌目；10日龄雄性肠道内生菌的优势菌目为肠杆菌目、拟杆菌目和Orbales;性成熟的雌性肠道内生菌主要是肠杆菌目、拟杆菌目、Orbales、乳杆菌目和气单胞菌目的细菌；性成熟的雄性成肠道内生菌主要是肠杆菌目、拟杆菌目、Orbales和乳杆菌目的细菌。在科的分类水平上,南亚实蝇羽化未取食雌性肠道内生菌主要分布在肠杆菌科和弧菌科；羽化未取食雄性肠道内生菌主要分布在肠杆菌科、紫单胞菌科、Orbaceae、肠球菌科、黄杆菌科、拟杆菌科、假单胞菌科、鞘脂杆菌科、黄单胞菌科、动性球菌科、普雷沃氏菌科、几丁质菌科、毛螺菌科和丛毛单胞菌科；10日龄雌性肠道内生菌主要分布在肠杆菌科和紫单胞菌科；10日龄雄性肠道内生菌在肠杆菌科、紫单胞菌科和Orbaceae中均有分布；性成熟的雌性肠道内生菌的优势菌科为肠杆菌科、紫单胞菌科、Orbaceae、肠球菌科和气单胞菌科的细菌；性成熟的雄性肠道内生菌的优势菌科为肠杆菌科、紫单胞菌科、Orbaceae和肠球菌科的细菌。在属的分类水平上,南亚实蝇羽化未取食雌性肠道优势菌群为肠杆菌属、克雷伯氏菌属及普罗维登斯属；羽化未取食雄性肠道内的一大优势菌属主要是拟杆菌门中的金黄杆菌属、紫单胞菌科的未知菌属、黄杆菌属、Orbus和拟杆菌属,其次是厚壁菌门中肠球菌科的未知菌属,最后是变形菌门中的Orbus、寡养单胞菌属、肠杆菌属、普罗威登斯菌属、沙雷氏菌属及假单胞菌属。10日龄雌性肠道优势菌群是普罗维登斯属、肠杆菌属、Dysgonomonas和沙雷氏菌属,10日龄雄性肠道内细菌在肠杆菌属、普罗威登斯菌属、Dysgonomonas和Orbus中均有分布,性成熟的雌性肠道内细菌在普罗威登斯菌属、Orbus、沙雷氏菌属、肠杆菌属、Dysgonomonas和阪崎肠杆菌中均有分布,性成熟的雄性肠道内生菌在Orbus、沙雷氏菌属、Dysgonomonas和肠杆菌属中均有分布。6个样品及组间的肠道菌群差异性分析表明,南亚实蝇雌或者雄性成虫不同发育阶段肠道菌群的结构及组成存在一定的差异性,而同一发育阶段雌、雄肠道菌群的结构和组成类似。从性成熟的雌、雄南亚实蝇肠道分离得到41种不同的可培养菌,均为肠杆菌科的细菌。雌、雄肠道共同的菌属是肠杆菌属、普罗维登斯菌属和沙雷氏菌属。室内引诱实验发现,所有供试菌株的高压灭菌液对南亚实蝇均有显著地引诱效果,其中四株菌Enterobacter cloacae (BF16)、Enterobacter sp. (BF(12))、Enterobacter sp. (BF23)和Enterobacter sp. (BF(32))的高压灭菌液对8日龄、性成熟的南亚实蝇的引诱效果较好,对8日龄南亚实蝇室内引诱率分别达到24.33%、20.67%、14.67%和14.00%,室外引诱率分别达到9.61%、5.61%、6.06%和8.83%；对性成熟的南亚实蝇室内引诱率分别达到25.33%、20.33%、21.00%和21.67%,室外引诱率分别达到1.06%、4.56%、7.56%和6.57%。
【关键词】：南亚实蝇 16S rDNA 肠道细菌 微生物多样性 引诱效果
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1 南亚实蝇概述13-14
• 1.1 分布及危害13
• 1.2 南亚实蝇生物学特性13
• 1.3 防治对策13-14
• 1.3.1 进出口检疫13-14
• 1.3.2 农业防治14
• 1.3.3 物理防治14
• 1.3.4 化学防治14
• 2 昆虫及肠道微生物14-19
• 2.1 昆虫肠道微生物的种类14-16
• 2.2 昆虫肠道共生菌对宿主昆虫的功能16-18
• 2.2.1 肠道共生菌群对昆虫的的营养及代谢影响16-17
• 2.2.2 肠道共生菌群对昆虫生理和生长发育的影响17
• 2.2.3 肠道共生菌对宿主昆虫寿命的影响17
• 2.2.4 昆虫肠道共生菌对宿主的防御、保护作用17-18
• 2.3 南亚实蝇肠道微生物研究进展18-19
• 3 细菌16S rRNA及其在肠道微生物研究中的应用19-20
• 3.1 16S rRNA基因简介19
• 3.2 16S rRNA基因在肠道微生物研究中的应用19-20
• 4 本研究的目的及意义20-21
• 5 本研究的特色与创新之处21
• 6 研究内容及技术路线21-23
• 6.1 研究内容21-22
• 6.2 技术路线22-23
• 第二章 南亚实蝇成虫肠道微生物多样性分析23-53
• 2.1 材料与方法23-30
• 2.1.1 实验材料23-24
• 2.1.1.1 供试虫源23
• 2.1.1.2 常用试剂及培养基23-24
• 2.1.1.3 实验仪器和设备24
• 2.1.2 实验方法24-30
• 2.1.2.1 南亚实蝇成虫肠道解剖24
• 2.1.2.2 肠道微生物基因组DNA提取及检测24-25
• 2.1.2.3 Illumina MiSeq PE300测序25-26
• 2.1.2.4 生物信息学分析26-30
• 2.2 结果与分析30-49
• 2.2.1 南亚实蝇成虫解剖30
• 2.2.2 样本细菌基因组DNA提取30-31
• 2.2.3 16S rDNA V3+V4区域扩增结果31-32
• 2.2.4 肠道细菌16S rDNA V3+V4区测序序列数据的统计32
• 2.2.5 样品OTU的统计分析32-33
• 2.2.6 南亚实蝇成虫不同发育阶段肠道微生物的复杂度分析33-36
• 2.2.6.1 绘制稀释性曲线34
• 2.2.6.2 Alpha多样性分析34-36
• 2.2.7 肠道细菌群落结构组成分析36-45
• 2.2.7.1 基于门分类水平进行分析36-38
• 2.2.7.2 基于纲水平进行分析38-39
• 2.2.7.3 基于目水平进行分析39-40
• 2.2.7.4 基于科水平进行分析40-41
• 2.2.7.5 基于属水平进行分析41-44
• 2.2.7.6 肠道菌群的系统进化分析44-45
• 2.2.8 样品及组间的肠道菌群差异性分析45-49
• 2.3 小结与讨论49-53
• 第三章 南亚实蝇成虫肠道细菌的分离与鉴定53-62
• 3.1 材料和方法53-54
• 3.1.1 供试虫源53
• 3.1.2 南亚实蝇成虫肠道解剖53
• 3.1.3 南亚实蝇成虫肠道菌的分离与纯化53
• 3.1.4 对从南亚实蝇肠道分离的菌株进行16S rRNA基因扩增53-54
• 3.1.5 构建南亚实蝇肠道菌的系统发育树54
• 3.1.6 序列登录号54
• 3.2 结果与分析54-60
• 3.2.1 肠道内分离的可培养菌及16S rDNA扩增结果54-55
• 3.2.2 单菌株16S rDNA序列分析结果55-57
• 3.2.3 肠道菌系统发育分析57-60
• 3.3 小结与讨论60-62
• 第四章 肠道细菌对南亚实蝇的引诱作用研究62-70
• 4.1 实验材料62
• 4.2 研究方法62-63
• 4.2.1 室内引诱效果测试62
• 4.2.1.1 引诱剂的制备62
• 4.2.1.2 室内小笼测试62
• 4.2.2 室外引诱测试62-63
• 4.2.2.1 高压灭菌液的制备62
• 4.2.2.2 室外大笼测试62-63
• 4.2.3 数据处理63
• 4.3 结果与分析63-69
• 4.3.1 室内引诱效果63-67
• 4.3.2 室外引诱效果67-69
• 4.4 小结与讨论69-70
• 第五章 总结与展望70-72
• 参考文献72-84
• 附录84-87
• 致谢87

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本文编号：430412