暗黑鳃金龟嗅觉基因的鉴定及特征分析

发布时间：2017-06-20 22:00

  本文关键词：暗黑鳃金龟嗅觉基因的鉴定及特征分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：暗黑鳃金龟Holotrichia parallela Motschulsky(Coleoptera:Melolonthidae)属于地下害虫重要类群之一,对农作物、果树以及林木等可以造成重大经济损失。嗅觉系统在昆虫正常生存和适应环境中均具有重要作用,能从成千上万种不同气味中识别出自己偏爱的气味物质,产生定位寄主食物、躲避天敌、寻求配偶、交配、产卵和栖息场所等特定的生理和行为反应。研究暗黑鳃金龟嗅觉识别机理和嗅觉相关蛋白的功能,有助于揭示暗黑鳃金龟感受和识别种内个体间、与不同昆虫物种间和寄主植物间的气味物质并引起相关行为反应的机制,为探索高效特异性昆虫诱集剂、驱避剂的开发提供可靠的靶标位点,为暗黑鳃金龟的生物防治开辟新的途径。本文分析鉴定了暗黑鳃金龟的嗅觉相关基因家族,并对气味结合蛋白Hpar OBP15a进行基因克隆和功能分析。主要研究结果如下:1.从暗黑鳃金龟雌虫触角和足部转录组中获得58,763条unigenes,平均长度为879 bp,识别获得Hpar OBP编码基因24个,Hpar CSP 8个,Hpar SNMP 4个,Hpar OR 28个,Hpar IR10个。其中,20个Hpar OBPs、7个Hpar CSPs、1个Hpar SNMP、21个Hpar ORs、6个Hpar IRs拥有完整的开放阅读框。OBP14、16、39属于Plus-C OBPs,OBP1、12、27、29属于Minus-C OBPs,其余OBPs均含有6个保守半胱氨酸。8个Hpar CSPs都含有信号肽、保守的4个半胱氨酸和相似的二级结构。Hpar ORs基因大致地分成group 1、group 2、group 3亚族,7个Hpar IRs基因被认为是暗黑鳃金龟触角特异基因。2.根据暗黑鳃金龟成虫触角转录组测序的结果,利用RT-PCR克隆了Hpar OBP15a基因;Real-time PCR方法分析了该基因在成虫不同部位的表达量差异,Hpar OBP15a基因全长534 bp(Gen Bank登录号:AK1834747),编码147个氨基酸,理论分子质量为15.7 kDa。Hpar OBP15a在雌虫触角中特异表达,在头、胸、足和翅中仅有微量表达。3.通过荧光竞争结合测定了Hpar OBP15a蛋白和植物绿叶气味以及已经鉴定的金龟子性信息素成分等58种气味分子的结合特征,Hpar OBP15a与46种气味化合物具有较好的亲和性,与十二烷、十二醇结合能力最强,其解离常数分别为8.5μmol/L和11.3μmol/L;同时,对性信息素(L-异亮氨酸甲酯和R-芳樟醇)也有一定的结合(解离常数分别为21.0μmol/L和18.5μmol/L)。Hpar OBP15a具有广泛的气味结合谱,其中对榆树挥发物十二烷的结合能力最强,因此该蛋白可能在暗黑鳃金龟对榆树的定位过程中具有重要作用。
【关键词】：暗黑鳃金龟 气味结合蛋白 Hpar OBP15a 气味受体 离子受体 荧光竞争结合
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.5
【目录】：

• 摘要10-11
• 英文摘要11-13
• 1 前言13-26
• 1.1 暗黑鳃金龟的研究概况13-16
• 1.1.1 暗黑鳃金龟的发生规律13-14
• 1.1.2 暗黑鳃金龟成虫的生态习性14
• 1.1.3 暗黑鳃金龟的防治14-16
• 1.2 昆虫感知的信息化合物16-18
• 1.2.1 植物挥发物16-17
• 1.2.2 昆虫信息素17
• 1.2.3 暗黑鳃金龟性信息素的应用研究17-18
• 1.3 昆虫嗅觉的化学感受机理研究18-24
• 1.3.1 昆虫嗅觉识别的一般过程18-19
• 1.3.2 气味结合蛋白的发现19
• 1.3.3 气味结合蛋白的一般特征及分类19-20
• 1.3.4 气味结合蛋白的最新结构研究20-21
• 1.3.5 气味结合蛋白的研究方法21
• 1.3.6 气味结合蛋白的生理功能及新发现21-22
• 1.3.7 昆虫嗅觉编码涉及的其他重要蛋白22-24
• 1.4 研究目的和意义24-26
• 2 材料与方法26-42
• 2.1 虫源及饲养方法26
• 2.2 主要的试剂及仪器26-29
• 2.3 暗黑鳃金龟雌虫触角和足转录组29-33
• 2.3.1 总RNA提取29-30
• 2.3.2 转录组测序流程及构建c DNA文库30
• 2.3.3 序列组装30-31
• 2.3.4 转录组信息的分析31-32
• 2.3.5 嗅觉基因的识别与分析32-33
• 2.4 暗黑鳃金龟Hpar OBP15a基因全长的克隆33-36
• 2.4.1 总RNA的提取和c DNA合成33
• 2.4.2 基因扩增33-34
• 2.4.3 序列分析34
• 2.4.4 Hpar OBP15a表达谱34-35
• 2.4.5 PCR产物的回收与纯化35
• 2.4.6 基因片段的连接35
• 2.4.7 重组质粒转化感受态细胞及阳性克隆验证35-36
• 2.5 Hpar OBP15a基因的原核表达及蛋白纯化36-40
• 2.5.1 质粒提取36-37
• 2.5.2 原核表达载体的构建37
• 2.5.3 Hpar OBP15a蛋白的诱导条件摸索37-38
• 2.5.4 SDS-PAGE电泳检测38-39
• 2.5.5 蛋白的纯化39-40
• 2.6 荧光竞争结合试验40-42
• 3 结果与分析42-79
• 3.1 暗黑鳃金龟雌虫触角和足转录组数据分析42-46
• 3.1.1 暗黑鳃金龟雌虫触角和足转录组数据概况42-43
• 3.1.2 暗黑鳃金龟雌虫触角和足转录组Unigene的KOG分析43
• 3.1.3 暗黑鳃金龟雌虫触角和足转录组Unigene的GO分类43-46
• 3.2 嗅觉相关基因注释与分析46-61
• 3.2.1 暗黑鳃金龟气味结合蛋白Hpar OBP的识别46-53
• 3.2.2 暗黑鳃金龟化学感受蛋白Hpar CSP的识别53
• 3.2.3 暗黑鳃金龟感觉神经元膜蛋白Hpar SNMP的识别53-55
• 3.2.4 暗黑鳃金龟气味受体Hpar OR的识别55-58
• 3.2.5 暗黑鳃金龟离子型受体Hpar IR的识别58-61
• 3.3 Hpar OBP15a基因全长的克隆61-64
• 3.3.1 暗黑鳃金龟触角、足总RNA检测61-62
• 3.3.2 Hpar OBP15a序列扩增62
• 3.3.3 Hpar OBP15a和p GEM-T4重组质粒PCR检测62-63
• 3.3.4 原核表达载体构建63-64
• 3.4 Hpar OBP15a基因序列分析64-69
• 3.4.1 Hpar OBP15a基因序列分析64-65
• 3.4.2 Hpar OBP15a预测蛋白理化性质分析65
• 3.4.3 Hpar OBP15a预测蛋白的疏水性分析65-66
• 3.4.4 Hpar OBP15a蛋白氨基酸序列及系统发育分析66-68
• 3.4.5 Hpar OBP15a基因的组织分布及相对表达量68-69
• 3.5 Hpar OBP15a基因原核表达及蛋白纯化69-74
• 3.5.1 Hpar OBP15a重组质粒的构建69-70
• 3.5.2 重组质粒p ET30-Hpar OBP15a的诱导表达70-74
• 3.6 Hpar OBP15a蛋白的荧光测定和配体结合试验74-79
• 4 讨论79-82
• 4.1 暗黑鳃金龟转录组分析79-80
• 4.2 Hpar OBP15a基因的克隆及分析80
• 4.3 Hpar OBP15a蛋白的荧光测定和配体结合试验80-82
• 5 结论82-83
• 致谢83-85
• 参考文献85-94
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文94

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本文编号：466931