四环素耐药基因在禽畜粪便、堆肥和土壤中的归趋

发布时间：2017-07-01 17:23

  本文关键词：四环素耐药基因在禽畜粪便、堆肥和土壤中的归趋，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细菌耐药性是目前全人类面临的最紧迫的公共卫生问题之一。耐药基因作为一种新型污染物质,在环境中的迁移和归趋日益受到研究者的关注。四环素在我国的禽畜养殖业中用量较大,是一种典型的广谱抗生素,对四环素耐药基因的分型和耐药机制研究的较为透彻,但对耐药基因在环境中迁移、归趋规律等的研究还远远不够。因此,本研究以四环素耐药(tet-R)基因和乳糖发酵型肠杆菌(LFE)为研究对象,采用传统微生物培养技术和现代分子生物技术,研究了上海市2家养猪场和养鸡场的禽畜粪便、粪便堆肥和施用堆肥土壤中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌(TR-LFE)中四环素耐药基因的分布以及禽畜粪便、堆肥和土壤中四环素耐药基因的变化,得出以下结论：(1) TR-LFE/LFE比值在猪粪、猪粪堆肥和施用猪粪堆肥的土壤中呈逐级降低趋势,在鸡粪和鸡粪堆肥中也是如此。(2)分别从养猪场样品中和养鸡场样品分离出540株和340株TR-LFE,选取不同耐药机制的10种tet-R基因的特异性引物,采用普通PCR方法对分离菌株进行了tet-R基因的检测,发现养猪场样品中的485株和养鸡场样品中289株TR-LFE携带有1种或1种以上的被检测的tet-R基因。(3)养猪场分离的TR-LFE中10种tet-R基因的平均检出率的顺序tet(A) tet(B) tet(M) tet(G) tet(C) tet(D), tet(S) tet(O) tet(X)tet(E)。养鸡场分离的TR-LFE中10tet-R基因的平均检出率的大小顺序为tet(A) tet(B) tet(M) tet(D) tet(G) tet(O) tet(C) tet(E), tet(S), tet(X)。外输泵基因tet(A)、tet(B)和核糖体保护蛋白基因tet(M)是本研究中分离的TR-LFE菌株中最主要的tet-R基因。(4)养猪场分离的TR-LFE中,tet(A)+tet(B)、tet(A)+tet(M)和tet(B)+tet(M)是检出率最高的双重tet-R基因型；tet(A)+tet(M)和tet(A)+tet(B)是鸡粪和堆肥中分离的TR-LFE菌株中双重tet-R基因检出率最高的类型。不同来源的TR-LFE中携带单重tet-R基因的检出率顺序为幼猪粪成猪粪土壤猪粪堆肥,多重tet-R基因的检出率的大小顺序为猪堆肥土壤成猪粪幼猪粪。猪粪堆肥中分离的TR-LFE不仅多重tet-R基因检出率是最高的,而且多重耐药基因的种类也是最多的。猪粪堆肥和鸡粪堆肥中分离的TR-LFE中的单重tet-R基因的种类也最多。(5)养猪场各样品抽提获得的总DNA中tet-R基因的检出率大小顺序为成猪粪幼猪粪猪粪堆肥土壤；养鸡场中各样品抽提获得的总DNA中tet-R基因的检出率的大小顺序为成鸡粪幼鸡粪鸡粪堆肥。(6)采用荧光定量PCR方法对养猪场和养鸡场样品中所含的tet(A)和tet(C)基因的含量进行检测,结果表明猪粪堆肥中tet(A)和tet(C)基因的含量比新鲜猪粪中的低0～3、1～4个数量级,土壤中的tet(A)和tet(C)的含量比猪粪堆肥中的均低0～1个数量级。鸡粪堆肥中tet(A)和tet(C)的含量比新鲜粪便中的分别减少了0～4、1～3数量级。据此推测tet-R基因在粪便、堆肥和土壤中呈逐级降低的趋势,堆肥过程可能有利于tet-R基因含量的降低。
【关键词】：四环素耐药基因 乳糖发酵性肠杆菌 禽畜粪便 堆肥 土壤 PCR 定量PCR
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X713;X53
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 英文缩略词表13-14
• 第1章 绪论14-32
• 1.1 抗生素简介14-17
• 1.1.1 抗生素的定义14
• 1.1.2 抗生素的种类14-15
• 1.1.3 抗生素的作用机理15-16
• 1.1.4 环境中抗生素的来源16
• 1.1.5 国内外抗生素的使用情况16-17
• 1.2 四环素类抗生素简介17-18
• 1.3 四环素耐药基因18-20
• 1.3.1 四环素耐药菌的耐药机制18-19
• 1.3.2 四环素耐药基因的来源19-20
• 1.4 环境中四环素耐药基因的研究情况20-23
• 1.4.1 禽畜养殖中四环素耐药基因20-21
• 1.4.2 土壤环境中的四环素耐药基因21-22
• 1.4.3 水环境中的四环素耐药基因22-23
• 1.5 四环素耐药基因在环境中的传播与扩散23-25
• 1.6 环境中四环素耐药基因的去除25-28
• 1.6.1 污水处理厂对四环素耐药基因的去除25-27
• 1.6.2 堆肥对四环素耐药基因的去除27-28
• 1.7 研究背景与意义28-29
• 1.8 研究内容与技术路线29-32
• 1.8.1 研究方法29-31
• 1.8.2 研究技术路线31-32
• 第2章 实验材料与实验方法32-40
• 2.1 样品采集32
• 2.2 实验材料32-33
• 2.2.1 实验试剂32
• 2.2.2 实验仪器32-33
• 2.3 定性PCR反应33-36
• 2.3.1 培养基配制33-34
• 2.3.2 细菌培养34
• 2.3.3 细胞全基因组DNA的提取34
• 2.3.4 PCR反应34-36
• 2.3.5 凝胶电泳实验36
• 2.4 荧光定量PCR36-40
• 2.4.1 样品中总DNA的提取与DNA浓度测定36
• 2.4.2 定性PCR36
• 2.4.3 标准品浓度36
• 2.4.4 荧光定量PCR反应36-37
• 2.4.5 标准曲线37-40
• 第3章 四环素耐药基因在猪粪、猪粪堆肥和土壤中的归趋40-61
• 3.1 养猪场各样品中的耐四环素乳糖发酵型肠杆菌40-45
• 3.1.1 细菌总数40-41
• 3.1.2 乳糖发酵型肠杆菌总数41-42
• 3.1.3 耐四环素乳糖发酵型肠杆菌总数42-43
• 3.1.4 耐四环素乳糖发酵型肠杆菌所占的百分比43-45
• 3.2 养猪场样品中TR-LFE中tet-R基因型的检出情况45-54
• 3.2.1 携带所检测的tet-R基因的TR-LFE总数45
• 3.2.2 TR-LFE中所检测tet-R基因型统计45-50
• 3.2.3 不同季节各样品中tet-R基因的检出情况50-54
• 3.3 养猪场各样品总DNA中tet-R基因检出情况54-56
• 3.4 养猪场各样品中tet-R基因的丰度56-59
• 3.4.1 养猪场各样品中tet(A)的含量56-58
• 3.4.2 养猪场各样品中tet(C)的含量58-59
• 3.5 本章小结59-61
• 第4章 四环素耐药基因在鸡粪、鸡粪堆肥中的归趋61-76
• 4.1 养鸡场各样品中耐四环素乳糖发酵型肠杆菌61-64
• 4.1.1 细菌总数61-62
• 4.1.2 乳糖发酵型肠杆菌总数62
• 4.1.3 耐四环素乳糖发酵型肠杆菌总数62-63
• 4.1.4 耐四环素乳糖发酵型肠杆菌所占的百分比63-64
• 4.2 养鸡场中TR-LFE中tet-R基因型分析64-71
• 4.2.1 携带所检测tet-R基因的TR-LFE总数64-65
• 4.2.2 TR-LFE中tet-R基因型统计65-68
• 4.2.3 不同季节各样品中tet-R基因的检出情况68-71
• 4.3 养鸡场各样品中总DNA中tet-R基因检出情况71-72
• 4.4 养鸡场各样品中tet-R基因的丰度72-75
• 4.4.1 养鸡场各样品中tet(A)的含量72-73
• 4.4.2 养鸡场各样品中tet(C)的含量73-75
• 4.5 本章小结75-76
• 第5章 总结与展望76-78
• 5.1 总结76-77
• 5.2 展望与建议77-78
• 附录1 tet-R基因扩增图谱78-82
• 附录2 各样品TR-LFE中的tet-R基因82-93
• 参考文献93-98
• 致谢98

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