四烯大环内酯类化合物的分离纯化和对植物病原真菌的抑菌活性研究

发布时间：2017-07-16 09:19

  本文关键词：四烯大环内酯类化合物的分离纯化和对植物病原真菌的抑菌活性研究

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【摘要】：项目组从浙江天目山采集的土壤中分离到一株对多种植物病原真菌具有较强抑制作用的放线菌,鉴定为淀粉酶产色链霉菌1628(Streptomyces diastatochromogenes 1628)。前期研究中发现该菌株发酵液的正丁醇萃取物中含有多种四烯大环内酯类化合物,本研究对正丁醇萃取物进行分离纯、纯化,获得3种四烯大环内酯类化合物单体,并对它们的抗菌活性进行了研究,进一步利用核糖体工程技术(Ribosome engineering)对淀粉酶产色链霉菌1628进行了遗传改造,提高了其产素水平。淀粉酶产色链霉菌1628发酵液正丁醇萃取物经过一次大孔树脂AB-8色谱柱层析、两次ODS色谱柱层析、TLC分析和HPLC检测。最终得到三种四烯大环内酯类化合物单体,编号为ODS5-8、ODS5-7-2、ODS-5-7-4。通过质谱、核磁共振分析,结合文献报道其中ODS5-8被鉴定为四霉素A(Tetramycin A),ODS5-7-2被鉴定为新的四霉素类抗生素,命名为四霉素P(Tetramycin P),ODS5-7-4被鉴定为四烯菌素B(Tetrin B)。建立了四烯大环内酯类化合物高效液相色谱检测方法,分析方法为:采用Waters Sun Fire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相A为甲醇,B为水,梯度洗脱,流速:1 ml/min;检测波长:304 nm,进样量:5μl,柱温:30℃。绘制Tetramycin A、Tetramycin P、Tetrin B HPLC标准曲线,在25~500 mg/L浓度线性范围内,R2依次为0.9914、0.9862、0.9963,线性关系良好,平均加样回收率依次为100.83%、100.15%、100.51%,RSD(%)分别为4.57、4.12、7.89,方法准确可靠。本测定方法简单、重复性强,可用于发酵液中三种四烯化合物在HPLC方法中的定性定量分析。利用菌丝生长速率法研究了Tetramycin A、Tetramycin P对水稻纹枯病菌(Rhizoctorzia solani)、黄瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)5种常见植物病原真菌的抑菌活性。结果表明Tetramycin A、Tetramycin P对5种植物病原菌菌丝生长抑制效果较好。Tetramycin A抑制5种病原菌菌丝生长的EC50值分别为3.93、2.13、3.27、5.36、5.99 mg/L,随着浓度的上升对5种植物病原真菌抑制效果增加,浓度为25 mg/L时平均抑制率为97.7%。Tetramycin P抑制5种病原菌菌丝生长的EC50值分别为3.83、3.29、3.31、4.96、5.65 mg/L,随着浓度的上升对5种植物病原真菌抑制效果增加,浓度为30 mg/L时平均抑制率为97.3%。利用孢子萌发率测定法测定Tetramycin A、Tetramycin P对黄瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌的孢子萌发率的影响,结果表明对两种病原菌孢子萌发抑制效果较好。Tetramycin A在浓度为125 mg/L时,对番茄灰霉病菌孢子萌发抑制效果较好,孢子萌发率为0%,黄瓜枯萎病菌孢子萌发率为4%,效果稍弱但仍显著低于对照。Tetramycin P在浓度为75mg/L时,对番茄灰霉病菌孢子抑制效果较好萌发率为0%,黄瓜枯萎病菌孢子萌发率为5%,效果稍弱但仍显著低于对照。实验表明Tetramycin A、Tetramycin P对常见的5种植物病原菌均有较好的抑菌活性。淀粉酶产色链霉菌1628可以合成四种不同的抗生素包括丰加霉素、Tetramycin A、Tetramycin P和Tetrin B。利用核糖体工程技术由链霉素、利福平、巴龙霉素、红霉素、庆大霉素和四环素6种抗生素诱导淀粉酶产色链霉菌1628突变,得到抗性突变株SD10、SD88、SD99、SD143、SD160、SD189和SD218,其中SD10、SD143为低浓度链霉素和高浓度链霉素诱导突变得到。7株突变株中,由红霉素诱导得到的突变株SD160产生的丰加霉素和Tetramycin A的浓度达到678 mg/L和1005 mg/L,分别为野生型1628产量的3.8和5.4倍;由巴龙霉素诱导得到的突变株SD99产生的Tetramycin P和Tetrin B的浓度达到1015 mg/L和583 mg/L,分别为野生型1628产量的3.8和5.1倍。结果表明核糖体工程技术可以有效的提高淀粉酶产色链霉菌1628中四种抗生素的产量,均较原始菌株提高了3~5倍不等,为四种抗生素实现生产化奠定了良好的基础。
【关键词】：淀粉酶产色链霉菌1628 四烯大环内酯类化合物 HPLC 抑菌活性 核糖体工程
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TQ927;S432.44
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-16
• 1 前言16-24
• 1.1 农用抗生素16-18
• 1.1.1 农用抗生素的研究背景16
• 1.1.2 农用抗生素使用的研究进展16-18
• 1.1.3 农用抗生素使用面临问题18
• 1.2 多烯大环内酯类化合物18-20
• 1.2.1 多烯大环内酯类化合物概述19
• 1.2.2 多烯大环内酯类化合物功能特点19-20
• 1.3 核糖体工程技术20-23
• 1.3.1 核糖体工程技术的研究背景20-21
• 1.3.2 核糖体工程技术的研究内容21-22
• 1.3.3 核糖体工程技术的研究进展22-23
• 1.4 本课题研究的内容及意义23-24
• 2 四烯大环内酯类化合物的分离纯化24-38
• 2.1 实验材料25
• 2.1.1 菌种25
• 2.1.2 主要试剂25
• 2.1.3 培养基25
• 2.1.4 主要仪器25
• 2.2 试验方法25-27
• 2.2.1 1628 液体发酵25-26
• 2.2.2 正丁醇萃取物的制备26
• 2.2.3 正丁醇浸膏的大孔树脂AB-8 柱层析26
• 2.2.4 大孔树脂AB-8 分离得到馏分的ODS分离纯化26-27
• 2.2.5 抗生素单体的结构鉴定27
• 2.3 结果与分析27-36
• 2.3.1 大孔树脂AB-8 柱层析结果27-29
• 2.3.2 ODS柱层析结果29-32
• 2.3.3 馏分ODS5-8、ODS572、ODS57-4 的结构鉴定32-36
• 2.4 讨论36-38
• 3 四烯大环内酯类化合物HPLC检测方法的建立38-43
• 3.1 仪器与试药38
• 3.2 方法与结果38-41
• 3.2.1 标准品溶液制备38
• 3.2.2 样品溶液制备38-39
• 3.2.3 色谱条件39
• 3.2.4 HPLC标准曲线绘制39-40
• 3.2.5 精密度、稳定性、重复性实验40-41
• 3.2.6 回收率实验41
• 3.2.7 样品测定41
• 3.3 讨论41-43
• 3.3.1 检测波长的选择41
• 3.3.2 流动相的选择41-42
• 3.3.3 检测方法评价42-43
• 4 四烯大环内酯类化合物对植物病原真菌抑菌活性研究43-50
• 4.1 实验材料43
• 4.2 试验内容43-44
• 4.2.1 Tetramycin A、Tetramycin P对植物病原真菌菌丝生长率的影响43-44
• 4.2.2 Tetramycin A、Tetramycin P对植物病原真菌孢子萌发率的影响44
• 4.3 数据与分析44-49
• 4.3.1 Tetramycin A、Tetramycin P对植物病原真菌菌丝生长率的影响44-47
• 4.3.2 Tetramycin A、Tetramycin P对植物病原真菌孢子萌发率的影响47-49
• 4.4 讨论49-50
• 5 利用核糖体工程技术提高1628次级代谢产物的产量50-55
• 5.1 实验材料50-51
• 5.1.1 菌株及抗生素50
• 5.1.2 培养基50-51
• 5.1.3 HPLC分析方法51
• 5.2 试验方法51-52
• 5.3 结果52-53
• 5.4 讨论53-55
• 6 总结与展望55-58
• 6.1 总结55-56
• 6.2 展望56-58
• 参考文献58-63
• 作者简历63

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