解淀粉芽孢杆菌NC6蛋白激发子PeBA1的分离鉴定及功能研究

发布时间：2017-07-25 21:30

  本文关键词：解淀粉芽孢杆菌NC6蛋白激发子PeBA1的分离鉴定及功能研究

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【摘要】：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是植物根际生长促进菌中非常重要的一类生防菌。研究表明,芽孢杆菌生防机制主要包括:竞争、拮抗、诱导抗病性及促进生长等4个方面。目前尚未有关于解淀粉芽孢杆菌大分子蛋白激发子的报道,本研究首次从解淀粉芽孢杆菌NC6菌株中分离纯化出一种能够诱导烟草产生系统抗病反应的新型蛋白激发子PeBA1,为进一步阐述解淀粉芽孢杆菌诱导抗病性提供一定的理论基础。具体实验内容与结果如下:1.蛋白激发子的分离纯化及质谱分析通过硫酸铵沉淀,阴离子柱交换层析,以及活性胶回收等一系列蛋白纯化方法,从解淀粉芽孢杆菌NC6菌株中获得一种能够诱导烟草叶片产生典型过敏反应的蛋白质激发子。并对该激发子进行质谱分析,获得其氨基酸序列,并命名为PeBA1(Protein elicitor from Bacillus amyloliquefaciens 1)。2.构建PeBA1原核表达及纯化系统克隆Pe BA1基因,并将目的基因与原核表达载体E1连接,最后转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行原核表达。进一步通过细胞超声破碎,Ni柱亲和层析,超滤除盐浓缩获得高浓度PeBA1重组蛋白。SDS-PAGE检测及诱导烟草叶片过敏性坏死活性测试实验验证原核表达的准确性。3.PeBA1的理化性质及诱导烟草防御反应进一步研究PeBA1重组蛋白的理化性质及诱导烟草防御反应。PeBA1重组蛋白能够在4、25、50、80、100℃水浴中孵育15min后保持良好的稳定性。其所能够引起枯斑三生烟烟草叶片过敏性坏死反应的最低浓度为5μM。PeBA1重组蛋白能够诱导烟草防御早期事件如活性氧爆发(包括过氧化氢、超氧负离子的产生)。同时PeBA1重组蛋白可以诱导产生大量的次生代谢产物,包括大量的酚类物质形成等,其能够增强细胞壁强度,阻止病原菌的侵染。4.PeBA1诱导烟草产生系统抗病性通过诱导烟草抗病性测试,我们发现PeBA1重组蛋白能够诱导烟草产生对灰霉病菌和烟草花叶病毒的抗性。PeBA1重组蛋白处理的烟草叶片接种灰霉菌后,病斑直径明显小于蛋白缓冲液处理组,PeBA1处理的烟草叶片接种TMV后所引起病斑数和病斑大小均少于或小于缓冲液处理,证明PeBA1重组蛋白能够诱导烟草产生系统抗病性。进一步研究发现,PeBA1重组蛋白处理烟草,能够诱导水杨酸途径相关抗病性基因如PR1a、PR1b和PR5和PAL,以及茉莉酸途径相关部分抗病性基因如COI1和PDF1.2的转录上调,同时也能够引起在水杨酸介导的系统获得抗病性和植物根围菌引起的诱导系统抗病性中起重要作用的NPR1的转录上调。
【关键词】：蛋白激发子 过敏反应 活性氧爆发 诱导系统抗病性
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 解淀粉芽孢杆菌12-14
• 1.1.1 解淀粉芽孢杆菌促生长活性12-13
• 1.1.2 解淀粉芽胞杆菌抗菌活性13
• 1.1.3 解淀粉芽孢杆菌诱导系统抗性13-14
• 1.2 微生物源蛋白质激发子14-15
• 1.2.1 真菌源蛋白激发子14-15
• 1.2.2 细菌源蛋白质激发子15
• 1.3 激发子引起的植物系统抗病性15-18
• 1.3.1 诱导系统抗病性和获得系统抗病性15-16
• 1.3.2 激发子诱导的植物抗病相关事件16-17
• 1.3.3 植物抗病性信号途径17-18
• 1.4 研究目的及意义18-19
• 1.5 试验方案19-20
• 第二章 解淀粉芽孢杆菌蛋白激发子的分离纯化及质谱分析20-26
• 2.1 实验材料20
• 2.1.1 菌株与植物材料20
• 2.1.2 实验试剂和仪器20
• 2.1.3 培养基与试剂配方20
• 2.2 实验方法20-22
• 2.2.1 解淀粉芽孢杆菌NC6的发酵液培养20-21
• 2.2.2 蛋白激发子的分离纯化21-22
• 2.3 实验结果与分析22-24
• 2.3.1 解淀粉芽孢杆菌激发子的分离与纯化22-23
• 2.3.2 解淀粉芽孢杆菌激发子的质谱鉴定23-24
• 2.4 本章小结与讨论24-26
• 第三章 蛋白激发子Pe BA1的基因克隆与原核表达26-35
• 3.1 实验材料26-27
• 3.1.1 菌株与植物材料26
• 3.1.2 实验试剂和仪器26
• 3.1.3 培养基及试剂配方26-27
• 3.2 解淀粉芽孢杆菌基因组提取27
• 3.3 Pe BA1基因克隆及载体构建27-28
• 3.3.1 Pe BA1基因克隆27
• 3.3.2 Pe BA1基因胶回收及连接转化27-28
• 3.4 质粒提取及转化表达28-29
• 3.5 Pe BA1的原核表达及纯化29-30
• 3.5.1 Pe BA1的原核重组表达29
• 3.5.2 Pe BA1重组蛋白的纯化及浓度测定29-30
• 3.6 结果与分析30-33
• 3.6.1 蛋白激发子Pe BA1基因的克隆30
• 3.6.2 Pe BA1原核表达载体的构建30-32
• 3.6.3 Pe BA1重组蛋白的表达纯化32-33
• 3.7 本章小结与讨论33-35
• 第四章 Pe BA1重组蛋白激发子理化性质及诱导烟草防御反应35-44
• 4.1 实验材料35
• 4.1.1 植物材料35
• 4.1.2 实验试剂和仪器35
• 4.1.3 培养基及试剂配方35
• 4.2 实验方法35-37
• 4.2.1 Pe BA1重组蛋白激发子理化性质35-36
• 4.2.2 Pe BA1重组蛋白诱导烟草产生早期防卫反应36-37
• 4.3 结果与分析37-42
• 4.3.1 Pe BA1重组蛋白引起典型的HR坏死37-38
• 4.3.2 Pe BA1重组蛋白的热稳定性38-39
• 4.3.3 Pe BA1重组蛋白引起过敏性坏死反应最低浓度39-40
• 4.3.4 Pe BA1重组蛋白诱导活性氧积累40-41
• 4.3.5 Pe BA1重组蛋白诱导烟草细胞内酚类物质的产生和积累41-42
• 4.4 本章小结与讨论42-44
• 第五章 Pe BA1诱导烟草产生系统抗病性44-52
• 5.1 实验材料44
• 5.1.1 植物及菌株材料44
• 5.1.2 实验试剂和仪器44
• 5.1.3 培养基及试剂配方44
• 5.2 实验方法44-46
• 5.2.1 Pe BA1诱导烟草产生对灰霉病菌的抗性44-45
• 5.2.2 Pe BA1诱导烟草产生对烟草花叶病毒（TMV）抗性45
• 5.2.3 荧光定量PCR检测Pe BA1诱导抗病相关基因表达45-46
• 5.3 实验结果与分析46-51
• 5.3.1 Pe BA1诱导烟草产生对灰霉病菌的抗性46-47
• 5.3.2 Pe BA1诱导烟草产生对烟草花叶病毒抗性47-49
• 5.3.3 Pe BA1诱导抗病相关基因转录上调49-51
• 5.4 本章小结与讨论51-52
• 第六章 全文结论52-53
• 参考文献53-59
• 致谢59-60
• 作者简历60

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