醛酮还原酶Bbakr1参与球孢白僵菌高渗和重金属铬胁迫反应

发布时间：2017-07-29 11:25

  本文关键词：醛酮还原酶Bbakr1参与球孢白僵菌高渗和重金属铬胁迫反应

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【摘要】：球孢白僵菌是一种广泛用于农、林以及卫生害虫生物防治的昆虫病原真菌,也是研究丝状真菌与宿主、环境互作的模式菌株之一。醛酮还原酶是一类NADP-依赖型氧化还原酶,广泛存在于原核和真核生物中,参与糖代谢及多种逆境胁迫反应,但在真菌中的功能研究鲜有报道。前期研究表明,与酵母Hog1同源的MAPK信号途径Bbhog1是球孢白僵菌逆境适应性和致病性的重要调控途径。为揭示Bbhog1调控球孢白僵菌逆境胁迫反应可能的分子学基础,课题组构建了野生型与ΔBbhog1在高渗胁迫条件下SSH文库,获得了15个在hog1信号阻断突变体中表达显著下调的基因。其中编号为H231的克隆与多种真菌的醛酮还原酶AKR编码基因高度同源,将其命名为Bbakr1。本论文利用基因破坏、回复互补和超量表达的策略研究了Bbakr1与球孢白僵菌发育分化、逆境胁迫反应和毒力的关系。主要的研究结果如下:1.Bbakr1序列分析与表达特性分析序列分析表明,Bbakr1含有930 bp的开放阅读框,编码310个氨基酸的多肽,推测的分子量约34.1 KDa。Bbakr1与多种真菌AKR同源蛋白高度同源。系统进化树分析显示,Bbakr1与昆虫病原真菌的蛹虫草(Cordyceps militaris)的AKR聚为一簇,推测其与蛹虫草AKR在进化上具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析表明,Bbakr1的表达受高渗和重金属铬胁迫诱导,且表达量随胁迫时间的变化而变化。由此推测,Bbakr1可能参与高渗胁迫反应与重金属铬的解毒反应。2.Bbakr1参与球孢白僵菌的产孢和发育分化为明确Bbakr1与球孢白僵菌发育分化及逆境胁迫反应和毒力的关系,本研究构建了基因破坏(ΔBbakr1)、回复互补(Comp)和超量表达(OE-Bbakr1)转化子,与亲本野生菌株(WT)进行了比较研究,结果表明,Bbakr1介导菌株孢子产生与发育分化。在基础培养基上,ΔBbakr1和OE-Bbakr1分生孢子产量比野生型菌株分别降低41%(P0.01)和10%(P0.05);在富营养培养基上,ΔBbakr1的分生孢子产量比WT降低15%(P0.01),而OE-Bbakr1和Comp与WT无显著差异。由此表明,Bbakr1介导球孢白僵菌分生孢子的产生。分生孢子萌发速率测定结果显示,破坏Bbakr1导致菌株的萌发速率降低,ΔBbakr1萌发中时比WT滞后0.72 h(P0.05),而OE-Bbakr1和Comp的萌发速率与WT无明显差异。可见,Bbakr1介导球孢白僵菌分生孢子的萌发。Bbakr1与球孢白僵菌芽生孢子产生和生物量积累相关。破坏Bbakr1导致菌株芽生孢子产量显著降低,同时降低了菌丝生物量积累,而OE-Bbakr1和Comp与WT无明显差异。3.Bbakr1与球孢白僵菌的高渗胁迫反应有关破坏Bbakr1增强了菌株对高渗胁迫敏感性,而OE-Bbakr1和Comp对高渗胁迫的敏感性与WT无明显差异。真菌细胞通常积累糖醇来适应高渗环境,胞内糖醇积累测定结果表明,破坏Bbakr1降低了胞内赤藓糖醇的积累,而超量表达Bbakr1则提高了胞内赤藓糖醇的积累。另外,破坏和超量表达Bbakr1干扰了胞内甘油、阿拉伯糖醇和甘露糖醇积累水平。由此推测,Bbakr1可能通过调节胞内糖醇(尤其是赤藓糖醇)的积累介导菌株的高渗胁迫反应。4.Bbakr1参与球孢白僵菌的重金属铬胁迫反应破坏Bbakr1提高了球孢白僵菌的对重金属铬的敏感性,而OE-Bbakr1和Comp与WT对铬的敏感性无显著差异。在重金属铬胁迫条件下,ΔBbakr1生长速率比WT降低约22%(P0.01)。重金属对细胞的毒害主要是由于引起胞内脂质过氧化反应和活性醛的积累。胞内脂质过氧化水平和丙二醛积累的测定结果表明,破坏Bbakr1导致菌株胞内脂质过氧化物降低,丙二醛含量提高。重金属铬胁迫4 h和6h时,ΔBbakr1胞内脂质过氧化物的含量分别比WT降低43.21%和12.74%(P0.01),丙二醛积累则分别是WT的6.0倍和3.4倍(P0.01)。由此推测,Bbakr1可能参与还原重金属铬引起脂质过氧化产生的活性醛,影响菌株对重金属铬的解毒作用。5.破坏和超量表达Bbakr1不影响球孢白僵菌的毒力生物测定的结果显示,破坏和超量表达Bbakr1对大蜡螟幼虫的毒力均无明显影响。
【关键词】：球孢白僵菌 醛酮还原酶 高渗 重金属铬
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.12
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 第一章 文献综述12-20
• 1.1 昆虫病原真菌12
• 1.2 醛酮还原酶超家族的研究进展12-16
• 1.2.1 醛酮还原酶超家族概述12-13
• 1.2.2 醛酮还原酶的结构13-14
• 1.2.3 醛酮还原酶的生物学功能14-16
• 1.3 重金属及其毒害16-18
• 1.3.1 重金属16-17
• 1.3.2 重金属的毒害作用17-18
• 1.4 小结18-20
• 第二章 引言20-22
• 2.1 研究目的和意义20-21
• 2.2 技术路线21-22
• 第三章 材料与方法22-36
• 3.1 材料22-24
• 3.1.1 供试菌株22
• 3.1.2 生物测定用虫22
• 3.1.3 质粒载体22
• 3.1.4 培养基及缓冲液22-23
• 3.1.5 引物23-24
• 3.2 方法24-36
• 3.2.1 菌株的保存与培养24
• 3.2.2 球孢白僵菌DNA和RNA的提取24-25
• 3.2.3 大肠杆菌的转化25-26
• 3.2.4 农杆菌感受态细胞的制备和转化26-27
• 3.2.5 农杆菌介导球孢白僵菌的遗传转化27
• 3.2.6 球孢白僵菌芽生孢子感受态制备及遗传转化27-28
• 3.2.7 Real time RT-PCR表达分析28-29
• 3.2.8 Bbakr1超量表达载体的构建及遗传转化29
• 3.2.9 ΔBbhog1中超量表达Bbakr1载体的构建及遗传转化29
• 3.2.10 球孢白僵菌菌落的形态观察和生长速率测定29
• 3.2.11 球孢白僵菌萌发速率测定29-30
• 3.2.12 球孢白僵菌产孢量测定30
• 3.2.13 分生孢子疏水性测定30-31
• 3.2.14 分生孢子附着性测定31
• 3.2.15 生物测定31-32
• 3.2.16 球孢白僵菌胞内糖醇测定32
• 3.2.17 脂质过氧化物(LPO)含量测定32-33
• 3.2.18 丙二醛(MDA)含量测定33-34
• 3.2.19 统计分析34-36
• 第四章 结果与分析36-52
• 4.1 Bbakr1的序列分析36-37
• 4.2 Bbakr1的表达特性37-39
• 4.3 超量表达转化子筛选39-40
• 4.4 Bbakr1参与球孢白僵菌的发育分化40-45
• 4.4.1 Bbakr1与球孢白僵菌的生长发育相关40-43
• 4.4.2 Bbakr1不参与球孢白僵菌分生孢子表面特性的形成43-45
• 4.5 破坏和超量表达Bbakr1不影响球孢白僵菌的毒力45
• 4.6 破坏Bbakr1影响球孢白僵菌的高渗适应性45-47
• 4.7 Bbakr1参与球孢白僵菌胞内糖醇积累47-48
• 4.8 破坏Bbakr1影响球孢白僵菌的重金属铬胁迫反应48-49
• 4.9 Bbakr1参与球孢白僵菌对重金属铬的解毒49-52
• 第五章 讨论52-56
• 5.1 Bbakr1参与球孢白僵菌生长发育的调控52-53
• 5.2 Bbakr1参与球孢白僵菌高渗适应性的调控53
• 5.3 Bbakr1解毒重金属铬的作用机理53-55
• 5.4 Bbakr1在球孢白僵菌中的生物学意义55-56
• 第六章 结论56-57
• 参考文献57-65
• 致谢65-67
• 附录Ⅰ 英文缩写67-71
• 附录Ⅱ 研究生期间论文发表情况71

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