青枯菌copSRABCD抗铜基因簇的功能研究

发布时间：2017-08-25 05:24

  本文关键词：青枯菌copSRABCD抗铜基因簇的功能研究

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【摘要】：由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum,简称青枯菌)引起的植物细菌性青枯病广泛分布于热带、亚热带、温带甚至高纬度地区,对农业生产构成了巨大威胁。由于青枯菌地域分布辽阔、寄主范围广泛、种内遗传结构复杂、且栽培寄主缺乏抗源,因此被公认为世界性重大病害。在我国,青枯病的防治主要依赖于使用铜制剂和农用链霉素进行灌根处理,铜制剂的泛滥使用导致土壤的重金属污染日益加重,并且植物病原细菌的抗铜菌株也接连被发现。迄今为止,尚未见青枯菌铜抗性及其分子机理相关领域的研究报道。本研究基于青枯菌Po82菌株的全基因组序列信息,以位于其大质粒上可能的铜抗性编码基因簇—copSRABCD为研究对象,采用单个基因和整体敲除策略,以期明确该基因簇及单个基因与青枯菌铜抗性、致病性等表型生物学特征之间的关系;本研究对阐明青枯菌铜胁迫应答的分子机制、治理重金属污染土壤、微生物冶金、指导田间用药等均有重要意义。1.铜抗性表型差异鉴定及copSRABCD基因簇的群体分布检测copSRABCD铜抗性基因簇在青枯菌群体中的分布验证结果显示:copSRABCD抗铜基因簇广泛分布于参试小样本的青枯菌群体中;但供试菌株铜抗性水平的测定结果却显示青枯菌的不同小种之间铜抗性表型存在着明显的差异。2.突变株及其相应互补菌株的构建基于青枯菌Po82菌株的全基因组序列信息,以位于其大质粒上可能的铜抗性编码基因簇copABCD为研究对象,采用单个基因和整体敲除策略,分别构建Po82菌株copABCD基因簇、基因簇内单个候选基因copB、copC的缺失突变株及其相应互补菌株。3.copABCD基因簇及单一候选基因功能验证突变株ΔcopABCD、ΔcopB、ΔcopC对青枯菌的致病性、运动性以及在铜逆境下的生长速率都具有一定的生物学功能,会导致青枯菌的致病能力减弱,运动性降低,在铜逆境的条件下生长速率减缓。4.常用的含铜杀菌剂及无铜杀菌剂对青枯菌4号小种抑菌活性的测定。通过对7种常用杀菌剂室内毒力试验的结果进行分析,发现中生菌素和氨基寡糖素在试验中表现出相当强的离体抑菌效果,远高于常用的含铜杀菌剂,且复配之后表现为增效效果,对于田间防治青枯病有良好的指导意义。
【关键词】：青枯菌 铜抗性 copSRABCD基因簇 致病力
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.42
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-26
• 1.1 青枯菌的危害及分类13-17
• 1.1.1 青枯菌及其引起的病害13
• 1.1.2 青枯菌的病害循环13-14
• 1.1.3 青枯菌传统分类方法14-15
• 1.1.4 青枯菌的演化型分类框架15-16
• 1.1.5 青枯菌发病症状及防治方法16-17
• 1.2 细菌与铜抗性17-24
• 1.2.1 铜的生理作用及毒性17
• 1.2.2 含铜杀菌剂的发展历程17
• 1.2.3 含铜杀菌剂的基本分类17-18
• 1.2.4 植物细菌病害的铜防治18-19
• 1.2.5 铜与重金属污染19
• 1.2.6 铜抗性菌株的发现19-20
• 1.2.7 细菌铜抗性分子机理20-22
• 1.2.8 细菌抗铜性与致病性的关系22
• 1.2.9 细菌铜抗性的应用22
• 1.2.10 青枯菌铜抗性研究现状22-24
• 1.3.本论文研究的目的意义和技术路线24-26
• 1.3.1 研究的目的和意义24
• 1.3.2 研究切入点24-25
• 1.3.3 技术路线图25-26
• 第二章 青枯菌群体的铜抗性表型差异与cop抗铜基因簇的群体分布26-36
• 2.1 试验材料26
• 2.1.1 主要试剂26
• 2.1.2 试验用菌株及相关培养基26
• 2.2 试验方法26-28
• 2.2.1 青枯菌铜抗性表型差异测定26-27
• 2.2.2 cop铜抗性基因簇在青枯菌群体中的分布检测27-28
• 2.3 试验结果28-34
• 2.3.1 供试菌株铜抗性水平测定结果28-32
• 2.3.2 cop铜抗性基因簇在青枯菌群体中的分布检测结果32-34
• 2.4 分析与讨论34-36
• 第三章 青枯菌copB、copC单基因生物学功能探索36-50
• 3.1 试验材料36-38
• 3.1.1 试验所用菌株、质粒和培养条件36
• 3.1.2 供试培养基36-38
• 3.1.3 所用实验仪器及试剂38
• 3.2 试验方法38-44
• 3.2.1 copB、copC基因敲除载体的构建38-41
• 3.2.2 copB、copC基因缺失菌株的构建41-42
• 3.2.3 copB、copC基因互补菌株的构建42-43
• 3.2.4 copB、copC基因缺失对青枯菌致病力影响的测定43-44
• 3.2.5 copB、copC基因基础生物学测定44
• 3.3 试验结果44-49
• 3.3.1 基因缺失菌株和互补菌株的筛选与鉴定44-45
• 3.3.2 copB、copC单基因缺失对青枯菌致病力的影响45-46
• 3.3.3 copB、copC单基因基础生物学测定结果46-49
• 3.4 分析与讨论49-50
• 第四章 青枯菌copABCD基因簇生物学功能探索50-61
• 4.1 试验材料50-51
• 4.1.1 试验所用菌株、质粒和培养条件50
• 4.1.2 供试培养基50
• 4.1.3 所用实验仪器及试剂50-51
• 4.2 试验方法51-56
• 4.2.1 copABCD基因簇敲除载体的构建51-53
• 4.2.2 copABCD基因簇的基因缺失菌株的构建53
• 4.2.3 copABCD基因簇的互补菌株的构建53-54
• 4.2.4 copABCD基因簇缺失对青枯菌致病力影响的测定54
• 4.2.5 copABCD基因簇的基础生物学测定54-55
• 4.2.6 实时荧光定量PCR检测copABCD基因簇相关单基因的表达55-56
• 4.3 试验结果56-60
• 4.3.1 copABCD基因簇缺失突变株和互补菌株的筛选与鉴定56-57
• 4.3.2 copABCD基因簇缺失对青枯菌致病力的影响57
• 4.3.3 copABCD基因簇的基础生物学测定结果57-59
• 4.3.4 copABCD基因簇相关单基因的表达检测结果59-60
• 4.4 分析与讨论60-61
• 第五章 七种杀菌剂对青枯菌4号小种Z-AQ-2 的抑菌活性测定研究61-69
• 5.1 试验材料61
• 5.1.1 供试杀菌剂61
• 5.1.2 供试培养基及菌株61
• 5.2 试验方法61-63
• 5.2.1 供试菌株的分离及PCR验证61
• 5.2.2 供试药剂毒力测定61-62
• 5.2.3 Colby法评价药剂混用效果62-63
• 5.2.4 数据分析63
• 5.3 杀菌剂毒力测定结果63-64
• 5.3.1 不含铜杀菌剂之间抑菌活性比较63
• 5.3.2 含铜杀菌剂之间抑菌活性比较63
• 5.3.3 含铜与不含铜的杀菌剂之间的抑菌活性比较63-64
• 5.4 Colby法对叶枯唑和氢氧化铜、叶枯唑和中生菌素以及中生菌素和氨基寡糖素的混用效果评价64-68
• 5.4.1 叶枯唑与中生菌素混用组合对青枯菌的抑菌效果64-65
• 5.4.2 叶枯唑与氢氧化铜混用组合对青枯菌的抑制效果65-66
• 5.4.3 氨基寡糖素与中生菌素混用组合对青枯菌的抑菌效果66-67
• 5.4.4 7种杀菌剂实验室用量与田间用量比对结果67-68
• 5.5 结论和讨论68-69
• 第六章 全文结论69-70
• 后续工作展望70-71
• 参考文献71-77
• 致谢77-78
• 作者简历78

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5 康耀卫;毛国璋;何礼远;;马铃薯青枯菌基因文库构建研究[A];“植物病虫害生物学研究进展”——植物病虫害生物学国家重点实验室研究论文选[C];1995年

6 张丽R

本文编号：735315