姜黄素对朱砂叶螨几丁质酶活性及基因表达的影响

发布时间：2017-08-25 10:22

  本文关键词：姜黄素对朱砂叶螨几丁质酶活性及基因表达的影响

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【摘要】：朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)可危害多种作物,是最重要的世界性经济害螨之一。该螨具有世代周期短、繁殖能力强等生物学特性,这种螨的特性加上长期以来化学杀螨剂的大量使用,使“3R”问题日益严重,因此迫切需要开发寻找高效低毒的新型螨类控制剂。植物源杀螨活性物质,易溶于水,对非标靶生物低毒,无残留,还可通过非目标生物体生物降解,因此,这些化合物成为新型螨类控制剂的重要选择对象之一。姜黄素(curcumin)主要提取于中药植物姜黄(Curcuma longa),研究发现,其对朱砂叶螨表现出较强的生物活性。天然产物农药研究室为验证姜黄素的杀螨活性,进行了大量的生物活性测定实验,发现经姜黄素处理后,螨出现大量失水、体表皱缩等死亡症状,这些症状表现说明姜黄素可能作用于螨的体壁结构。几丁质是螨体壁的主要组成成分,其合成和降解在螨的生长发育过程中有至关重要的作用。但是目前对姜黄素的致死机制研究多集中在解毒酶系活性的变化,而其对几丁质的合成和降解酶系的影响尚未研究报道。本研究以几丁质酶为切入点,从生理生化及分子水平两个方面研究了姜黄素处理下朱砂叶螨几丁质酶的变化,从而推测对几丁质降解的影响,以期为探明姜黄素对朱砂叶螨的作用机制提供依据。主要研究结果如下:1.测定了姜黄素对朱砂叶螨雌成螨的触杀毒力,得到了各亚致死剂量利用玻片浸渍法测得姜黄素处理朱砂叶螨48 h后的毒力回归方程为y=-0.474+1.234x,LC50为2.424 mg/mL,95%的置信区间为1.715~3.733 mg/mL。48 h后的亚致死剂量即LC40、LC30、LC20、LC10分别为1.511、0.911、0.504和0.222 mg/mL。测定了各亚致死剂量姜黄素处理下对朱砂叶螨发育历期的影响。结果表明,朱砂叶螨卵期、幼螨期、若螨期和成螨期与对照相比总体上呈缩短的趋势,并无显著差异,但是雌成螨的平均寿命显著缩短。2.明确了朱砂叶螨几丁质酶的基本酶学性质利用改良的schales法,研究了朱砂叶螨几丁质酶的基本酶学性质,包括最适反应温度及热稳定性、最适反应pH及pH稳定性、金属离子对酶活性的影响和动力学常数Km值。朱砂叶螨几丁质酶的最适反应温度约为35℃,对高温比较敏感;最适反应pH约为7.0,在pH值为6.0时最稳定;金属离子对几丁质酶活性存在影响,大部分的金属离子对酶有较强的抑制作用,但也有少数的金属离子对酶有激活作用;水解胶状几丁质的Km值为5.15μmol/L。这些研究结果进一步丰富了螨类相关几丁质酶生物学特性研究,可为基于几丁质酶的杀螨剂筛选奠定理论基础。在测定了朱砂叶螨几丁质酶酶学性质的基础上,进一步测定了螨不同发育阶段酶活性的情况。分析结果表明,卵期酶比活力最低,若螨期酶比活力最高,且卵期和若螨期具有显著性差异。这可能因为幼螨和若螨期是螨蜕皮发育的阶段,急需几丁质酶发挥作用,促进几丁质的降解。用不同浓度姜黄素处理朱砂叶螨雌成螨24 h后,随着浓度的升高几丁质酶比活力不断降低,在2.0和4.0 mg/mL时与对照相比已存在显著差异,特别在4.0 mg/mL,对几丁质酶的抑制率达到了约32%。由此推测,姜黄素的杀螨作用机制可能与几丁质酶有关。3.克隆并分析了6条朱砂叶螨几丁质酶基因(chitinase,TcCHTs)的cDNA序列参考朱砂叶螨近缘种二斑叶螨(Tetranychus urticae)的全基因组信息,利用RT-PCR技术,克隆获得了6条TcCHTs的cDNA序列。这6条基因分别命名为TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3、TcCHT4、TcCHT5和TcCHT6,GenBank登录号分别为KT956964、KT956965、KT956966、KT956967、KT956968和KT9569692。6条几丁质酶基因的结构域存在差异:其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和TcCHT4推导的氨基酸序列含有一个信号肽、一个催化结构域和一个几丁质结构域,而TcCHT5和TcCHT6由跨膜域代替了信号肽。预测蛋白质分子质量分别为60.80、69.03、104.32、59.75、45.63和49.05 kDa,等电点分别为5.44、8.65、6.23、6.07、6.12和8.27。构建系统发育树,结果显示这6条基因与各自相对应的二斑叶螨基因聚在同一支上。4.测定了朱砂叶螨TcCHTs基因在不同发育阶段及姜黄素处理后表达量的差异在完成了对6条TcCHTs克隆与分析的基础上,利用RT-qPCR测定了其在朱砂叶螨不同发育阶段的表达量。结果显示,幼螨和若螨期的基因表达量显著高于卵期和成螨期,其中TcCHIT1、TcCHIT2、TcCHIT3和TcCHT4 4条基因的这种差异更加明显,前者甚至高出后者近百倍。用不同浓度姜黄素处理朱砂叶螨若螨24 h后,6条基因的表达量均有不同程度的降低,其中TcCHIT1和TcCHT5的下降程度更加显著。
【关键词】：姜黄素 朱砂叶螨 几丁质酶 酶活性 基因表达
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433.7
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1 姜黄素的生物活性多样性研究13-15
• 1.1 姜黄素的药理活性研究现状13-14
• 1.2 姜黄素的杀虫抑菌活性研究现状14
• 1.3 姜黄素的杀螨活性研究现状14-15
• 2 植物源杀螨剂的研究现状15-16
• 3 几丁质酶及其抑制剂的研究16-20
• 3.1 微生物几丁质酶17
• 3.2 植物几丁质酶17
• 3.3 昆虫几丁质酶17-20
• 4 论文选题依据及研究内容20-23
• 4.1 选题依据20
• 4.2 研究内容20-23
• 第二章 姜黄素对朱砂叶螨的毒力及对发育历期的影响23-29
• 第一节 姜黄素对朱砂叶螨的毒力测定23-25
• 1 材料与方法23-24
• 1.1 供试螨类23
• 1.2 供试药剂23-24
• 1.3 生物活性测定方法24
• 1.4 数据分析24
• 2 结果与分析24-25
• 2.1 姜黄素对朱砂叶螨雌成螨的触杀毒力24
• 2.2 姜黄素对朱砂叶螨实验种群的亚致死剂量24-25
• 3 小结与讨论25
• 第二节 亚致死剂量姜黄素处理朱砂叶螨卵后发育历期比较25-29
• 1 材料与方法26
• 1.1 供试螨类26
• 1.2 供试药剂26
• 1.3 试验方法26
• 1.4 数据分析26
• 2 结果与分析26-27
• 3 小结与讨论27-29
• 第三章 姜黄素对朱砂叶螨几丁质酶活性的影响29-41
• 第一节 朱砂叶螨几丁质酶的酶学性质29-36
• 1 材料与方法29-32
• 1.1 供试螨类29
• 1.2 主要试剂和仪器29-30
• 1.3 试剂配制30
• 1.4 酶源制备30
• 1.5 酶源蛋白含量测定30-31
• 1.6 几丁质酶活性测定31
• 1.7 朱砂叶螨几丁质酶的酶学性质测定31-32
• 2 结果与分析32-35
• 2.1 牛血清蛋白标准曲线及N-乙酰-D-氨基葡萄糖标准曲线的制作32-33
• 2.2 几丁质酶最适温度及热稳定性33
• 2.3 几丁质酶最适反应pH值及pH稳定性33-34
• 2.4 金属离子对酶活性的影响34
• 2.5 动力学常数K_m的测定34-35
• 3 小结与讨论35-36
• 第二节 朱砂叶螨几丁质酶在不同发育阶段及姜黄素处理后活性差异36-41
• 1 材料与方法36-37
• 1.1 供试螨类36
• 1.2 主要试剂和仪器36
• 1.3 试剂配制36
• 1.4 酶源制备36
• 1.5 酶源蛋白含量测定36-37
• 1.6 几丁质酶活性测定37
• 1.7 数据分析37
• 2 结果与分析37-38
• 2.1 朱砂叶螨不同发育阶段几丁质酶活性比较37
• 2.2 姜黄素对朱砂叶螨雌成螨几丁质酶活性的影响37-38
• 3 小结与讨论38-41
• 第四章 姜黄素对朱砂叶螨几丁质酶基因表达的影响41-61
• 第一节 朱砂叶螨几丁质酶基因克隆及序列分析41-54
• 1 材料与方法41-46
• 1.1 供试螨类41
• 1.2 主要试剂和仪器41-42
• 1.3 试剂配制42
• 1.4 总RNA的提取42-43
• 1.5 第一链cDNA的合成43-44
• 1.6 引物设计44
• 1.7 PCR反应44-45
• 1.8 PCR产物克隆和测序45
• 1.9 基因序列生物信息学分析45-46
• 2 结果与分析46-54
• 2.1 朱砂叶螨总RNA的提取46
• 2.2 朱砂叶螨TcCHTs基因扩增结果46-47
• 2.3 朱砂叶螨TcCHTs基因序列生物信息学分析47
• 2.4 朱砂叶螨TcCHTs基因同源性分析47-54
• 3 小结与讨论54
• 第二节 朱砂叶螨TcCHTs基因在不同发育阶段及姜黄素处理后表达模式分析54-61
• 1 材料与方法55-57
• 1.1 供试螨类55
• 1.2 主要试剂和仪器55
• 1.3 总RNA的提取55
• 1.4 第一链cDNA的合成55
• 1.5 引物设计55-56
• 1.6 溶解曲线分析56
• 1.7 定量PCR56-57
• 1.8 数据分析57
• 2 结果与分析57-60
• 2.1 引物扩增效率57
• 2.2 朱砂叶螨不同发育阶段几丁质酶基因的表达模式57-59
• 2.3 不同浓度姜黄素对朱砂叶螨几丁质酶基因mRNA表达的影响59-60
• 3 小结与讨论60-61
• 第五章 结论与展望61-63
• 1 主要结论61-62
• 2 展望62-63
• 参考文献(References)63-71
• 致谢71-73
• 在读期间发表论文73

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