木霉素合成基因簇（tri）的克隆与tri3、tri11、tri4基因功能研究

发布时间：2017-08-28 14:52

  本文关键词：木霉素合成基因簇（tri）的克隆与tri3、tri11、tri4基因功能研究

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【摘要】：木霉素(Trichodermin)是单端孢霉烯类化合物的一种,主要是由脐孢木霉菌(Trichoderma brevicompactum)产生,对多种植物病原真菌具有较强的抑制作用。为研究脐孢木霉菌tri基因簇中各基因与木霉素合成的关系,本研究以脐孢木霉菌0248为实验材料,进行了三个方面的研究,主要结果及结论如下:(1)克隆得到脐孢木霉菌0248的tri基因簇,全长24793 bp,其中包含7个与镰刀菌TRI基因同源的开放阅读框,经鉴定这7个开放阅读框依次为tri6、tri4、tri3、tri10、tri11、tri12、tri14基因,但是与TRI5基因同源的tri5基因并不在基因簇内。0248中的tri基因与已报道的脐孢木霉菌IBT 40841和苇状木霉(T.arundinaceum)IBT 40837中相对应的基因具有较高的同源性,三株菌中tri基因编码的蛋白同源性都在90%以上,但IBT 40841、IBT 40837和0248在tri11与tri12基因之间的间隔长度上存在明显差异。(2)利用q PCR分析基因簇中各基因在三种不同产素水平下的表达差异,结果显示:高产素培养基中,培养40 h时tri基因表达量远高于其在低产或不产素培养基中基因表达量,即tri基因簇中基因表达量与木霉素的产量呈正相关。(3)分别构建了tri3、tri11、tri4基因的敲除载体pKT3、pKT11、pKT4,以农杆菌介导的同源重组策略分别敲除tri3、tri11、tri4基因,筛选得到三个不同基因的缺失株,并分别命名为△tri3、△tri11、△tri4。△tri3转化株发酵液中木霉素含量大幅降低,根据木霉素的化学结构以及tri3基因同源性分析得出:tri3基因编码的蛋白功能是催化木霉醇的骨架C-4位置羟基的乙酰化。tri3基因的敲除对tri基因簇转录水平影响的研究表明:tri3基因敲除后对基因簇中的基因表达起到了反馈调节的作用。tri3基因敲除后,木霉素仍有少量产生,推测是由于菌内存在的乙酰转移酶同工酶在起作用。tri11基因敲除后,发酵液中木霉素的含量为零,据此我们得出tri11基因直接参与木霉素的合成,基因序列分析显示tri11基因含有P450单加氧酶家族的保守结构,推测tri11基因编码的蛋白功能为:催化EPT(12,13-epoxytrichothec-9-ene)骨架上C-4位置上的羟基化。△tri4转化株发酵液中木霉素含量为零,据此可以确定tri4基因直接参与木霉素的合成。根据苇状木霉菌中tri4基因功能推测tri4基因编码细胞色素P450单加氧酶,其功能是催化单端孢霉二烯发生3步氧化反应,生成异单端孢霉二醇。
【关键词】：脐孢木霉菌 木霉素 tri基因簇 基因敲除
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 致谢6-8
• 摘要8-10
• Abstract10-17
• 1 绪论17-28
• 1.1 木霉菌的研究概况17-18
• 1.2 木霉菌的的生防作用及生防机制18
• 1.3 单端孢霉烯类化合物的主要性质18-23
• 1.3.1 单端孢霉烯类化合物的分类18-19
• 1.3.2 木霉素简介及其生防作用19-20
• 1.3.3 单端孢霉烯类化合物的合成途径20-23
• 1.4 真菌基因敲除研究进展23-26
• 1.4.1 基因敲除载体构建方法24-25
• 1.4.2 基因敲除载体的转化体系25-26
• 1.5 研究内容及意义26-28
• 1.5.1 研究的主要内容26-27
• 1.5.2 研究的重要意义27-28
• 2 脐孢木霉菌0248中tri基因簇的克隆与序列分析28-44
• 2.1 实验材料及仪器28-29
• 2.1.1 菌株及质粒28
• 2.1.2 培养基及主要试剂28
• 2.1.3 试剂盒、酶及耗材28-29
• 2.1.4 主要仪器29
• 2.2 方法29-34
• 2.2.1 脐孢木霉菌0248的保藏与培养29-30
• 2.2.2 脐孢木霉菌0248中总DNA的提取30
• 2.2.3 脐孢木霉菌0248中总RNA的提取及反转录30-31
• 2.2.4 脐孢木霉菌0248中tri基因簇的克隆31-33
• 2.2.5 基因簇的拼接及序列分析33-34
• 2.3 tri基因在不同碳源培养下的差异表达分析34-35
• 2.3.1 不同碳源培养下总cDNA的获取34
• 2.3.2 不同碳源培养下tri基因表达量分析34-35
• 2.3.3 不同碳源培养下木霉素产素水平分析35
• 2.4 结果与分析35-41
• 2.4.1 基因簇全长与序列分析35-36
• 2.4.2 基因簇的同源性分析36-38
• 2.4.3 不同产素水平下基因表达量的分析38-41
• 2.4.4 木霉素产量分析41
• 2.5 讨论41-44
• 2.5.1 0248与苇状木霉菌tri基因簇之间有较高同源性41-42
• 2.5.2 0248中木霉素产量与tri基因表达量呈正相关42-44
• 3 脐孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因的分析与敲除44-63
• 3.1 材料44-46
• 3.1.1 菌株及质粒44
• 3.1.2 培养基及主要试剂44-45
• 3.1.3 试剂盒、酶及耗材45
• 3.1.4 仪器设备45-46
• 3.2 脐孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因序列分析46
• 3.3 基因敲除载体的构建46-50
• 3.3.1 基因敲除同源重组片段的构建46-49
• 3.3.2 重组质粒的构建49-50
• 3.4 农杆菌介导转化敲除tri3、tri11、tri4基因50-53
• 3.4.1 农杆菌感受态制备50-51
• 3.4.2 重组载体pKT3、pKT11、pKT4转化农杆菌51
• 3.4.3 农杆菌介导tri3、tri11、tri4基因敲除片段转化0248基因组51-52
• 3.4.4 tri3、tri11和tri4基因敲除突变体的验证52-53
• 3.5 结果53-61
• 3.5.1 脐孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因序列分析53-58
• 3.5.2 tri3、tri11和tri4基因敲除载体的构建58-59
• 3.5.3 从基因组水平验证tri3、tri11和tri4基因敲除转化株59-61
• 3.6 讨论61-63
• 3.6.1 融合PCR技术构建载体61-62
• 3.6.2 无启动子终止子的潮霉素抗性基因有助于提高阳性克隆比例62-63
• 4 脐孢木霉菌0248中tri3、tri11、tri4基因功能分析63-74
• 4.1 材料63
• 4.1.1 菌株及质粒63
• 4.1.2 培养基及主要试剂63
• 4.1.3 试剂盒、酶及耗材63
• 4.1.4 主要仪器63
• 4.2 方法63-64
• 4.2.1 tri3、tri11和tri4基因敲除转化株的遗传稳定性分析63-64
• 4.2.2 tri3、tri11和tri4基因敲除转化株中基因表达量分析64
• 4.2.3 tri3、tri11和tri4基因敲除转化株中木霉素产量分析64
• 4.3 结果64-71
• 4.3.1 tri3、tri11和tri4基因敲除转化株具有遗传稳定性64-65
• 4.3.2 tri3、tri11和tri4基因缺失影响tri基因的转录水平65-69
• 4.3.3 tri3、tri11和tri4基因敲除对木霉素产量的影响69-71
• 4.4 讨论71-74
• 4.4.1 tri3基因编码蛋白催化木霉醇C-4位置羟基乙酰化71
• 4.4.2 tri11基因编码蛋白催化EPT骨架上C-4位置的羟基化71-72
• 4.4.3 tri4基因编码蛋白直接参与木霉素的合成72-74
• 5 总结与展望74-76
• 5.1 全文总结74-75
• 5.2 展望75-76
• 参考文献76-84
• 作者简介84

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1 袁小枫;木霉素合成基因簇（tri）的克隆与tri3、tri11、tri4基因功能研究[D];中国计量大学;2016年

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本文编号：748171