桔小实蝇保幼激素信号通路Met和Kr-h1基因功能初探

发布时间：2017-08-29 00:34

  本文关键词：桔小实蝇保幼激素信号通路Met和Kr-h1基因功能初探

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【摘要】：桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)隶属双翅目Diptera、实蝇科Tephritidae,广泛分布于热带和亚热带地区。由于极强的环境适应和扩散入侵能力,桔小实蝇被多个国家和地区列为检疫性害虫,对国际贸易造成了诸多限制;同时由于其寄主范围广、繁殖力强、造成的经济损失严重,因此该虫是果蔬上的危险性害虫。桔小实蝇一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个发育阶段,其成虫将卵产于果皮之下,幼虫孵化后取食果肉,造成果实脱落或失去经济价值。变态发育作为桔小实蝇重要的生理过程,具有重要的研究意义。在昆虫中,蜕皮激素和保幼激素协同作用,共同参与调控昆虫的蜕皮和变态发育。相对于蜕皮激素信号通路,保幼激素(Juvenile hormone,JH)分子作用机制还远未清楚。本学位论文基于桔小实蝇基因组及转录组数据库信息,运用RT-PCR技术,从桔小实蝇体内克隆获得了JH信号通路基因Met和Kr-h1的开放阅读框(ORF),并对其特征序列进行了注释;利用qPCR技术解析了桔小实蝇Met和Kr-h1的时空表达模式,同时明确和记录了外源激素(JH III和烯虫酯Methoprene)处理后桔小实蝇幼虫及蛹的应激表达模式及其表型变化;在此基础上,利用RNAi探索了Met和Kr-h1在桔小实蝇变态发育过程中的功能。研究结果不仅有助于了解昆虫生长发育机理,还有利于寻找新的杀虫靶标,为实蝇类害虫的持续防控提供新的思路和方法。主要研究结果如下:1桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因的克隆与序列分析基于桔小实蝇基因组和转录组数据库,克隆获得了JH信号通路Met和Kr-h1基因的ORF,并推导了其编码的氨基酸序列。进一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP 4.1以及TMHMM等生物信息学软件分析了Met、Kr-h1基因推导的蛋白质的保守序列、跨膜结构等潜在的生理功能。2桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因的时空表达模式2.1桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因在不同发育阶段的表达模式利用qPCR技术解析了JH信号通路Met、Kr-h1基因在桔小实蝇卵、幼虫、蛹及成虫1日龄的mRNA表达模式。结果表明,Met基因在桔小实蝇整个发育阶段持续表达,但幼虫期的表达量明显高于蛹期。幼虫期呈现不规律的波浪形起伏,在末龄期的第9日龄达到高峰,之后在蛹期持续低表达,推测该基因在桔小实蝇变态发育的过程中起着重要作用。Kr-h1基因变化更为显著,其在卵期有较高的相对表达量,而在幼虫第3、4日龄有明显的下调现象,在进入3龄幼虫期的第5日龄开始出现持续上调直至蛹期第1日龄,同样在即将化蛹的幼虫第9日龄出现高峰。此外,Met、Kr-h1基因均在蛹-成虫的转变过程中出现上调。Kr-h1基因在响应桔小实蝇JH变化过程中发挥了极大的作用,是桔小实蝇变态发育的重要调控因子。2.2桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因在幼虫不同组织的表达模式利用qPCR技术解析了JH信号通路Met、Kr-h1基因在桔小实蝇3龄幼虫脂肪体、马氏管、中肠、气管和表皮组织中的表达模式。结果表明,2个基因均在桔小实蝇幼虫马氏管中表达量最高,其次为脂肪体,而分别在幼虫气管、中肠中表达量最低。3 JH III和Methoprene对桔小实蝇Met和Kr-h1基因表达的影响3.1 JH III和Methoprene对桔小实蝇幼虫Met和Kr-h1基因表达的影响利用点滴法分别对桔小实蝇4日龄幼虫施用JH III和Methoprene。于处理后的6 h、10 h和24 h,分别检测桔小实蝇Met、Kr-h1基因的表达量。qPCR结果表明,两种化合物均对Met基因无明显的刺激作用;两种激素处理后的24 h,Kr-h1基因表达量均出现显著性上调,最终导致幼虫在化蛹后形态上出现了介于幼虫和蛹之间的“中间形态”。此外,相对JH III,Kr-h1基因对Methoprene更敏感。3.2 JH III和Methoprene对桔小实蝇蛹Met和Kr-h1基因表达的影响利用点滴法分别对桔小实蝇初蛹(12 h)施用JH III和Methoprene。于处理后的1 d、3 d、5 d、7 d,分别检测桔小实蝇Met和Kr-h1基因的表达量。qPCR结果表明,两种激素处理对Met基因表达量无显著影响;而Kr-h1基因表达水平在激素处理下显著上调,其中Methoprene处理后的第7天,Kr-h1上调倍数达到79.5,最终导致桔小实蝇蛹由于不能正常羽化而死亡。4桔小实蝇Met和Kr-h1基因的功能初探分别将合成好的Met、Kr-h1基因dsRNA混入染料胭脂虫红,对桔小实蝇4日龄幼虫进行饲喂法RNA干扰,并通过qPCR技术检测目的基因的沉默效果。结果表明,在iMet处理24 h后,与对照相比,Met基因表达水平显著下调56.2%,同时Kr-h1基因表达量也受到显著抑制,分别下调了71.1%(24 h)和42.3%(48h);在iKr-h1处理24 h和48 h后,Kr-h1基因表达水平分别显著下调78.9%和40%。上述沉默效率表明饲喂法对桔小实蝇幼虫RNA干扰是切实可行的。此外,RNA干扰的试虫在化蛹时间上并没有提前,即没有出现幼虫龄期缩短的现象,但相较于对照PBS,有一定的发育滞后现象。
【关键词】：桔小实蝇 保幼激素 信号通路 定量PCR RNA干扰
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S433
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 第一章 文献综述13-23
• 1 桔小实蝇形态特征及幼虫龄期划分13
• 2 昆虫保幼激素13-15
• 2.1 天然保幼激素及保幼激素类似物13-14
• 2.2 双翅目昆虫JH14-15
• 2.3 蜕皮激素和JH共同调控昆虫蜕皮和变态发育15
• 3 JH信号通路基因15-20
• 3.1 JH受体Methoprene-tolerant (Met)15-17
• 3.2 昆虫变态发育抑制因子Kr-h117-19
• 3.3 Broad基因19-20
• 4 JH信号通路与昆虫其它激素信号通路的相互作用20-23
• 4.1 JH与蜕皮激素信号通路20-21
• 4.2 JH与胰岛素类多肽21-23
• 引言23-25
• 第二章 桔小实蝇JH信号通路基因的克隆及序列分析25-35
• 1 材料和方法25-29
• 1.1 供试昆虫25-26
• 1.2 主要仪器及试剂26
• 1.3 总RNA提取26-27
• 1.4 总RNA中gDNA的去除27
• 1.5 cDNA合成27-28
• 1.6 引物设计和合成28
• 1.7 PCR扩增反应28-29
• 1.8 克隆和测序29
• 1.9 生物信息学分析29
• 2 结果与分析29-33
• 2.1 桔小实蝇JH信号通路Met和Kr-h1基因的ORF克隆及保守氨基酸序列分析Methoprene-tolerent (Met)29-33
• 3 讨论33-35
• 第三章 桔小实蝇JH信号通路基因的时空表达模式分析35-41
• 1 材料和方法35-37
• 1.1 供试昆虫35
• 1.2 实验试剂及仪器35
• 1.3 总RNA提取35-36
• 1.4 cDNA合成36
• 1.5 引物设计和合成36-37
• 1.6 实时定量PCR37
• 1.7 数据分析37
• 2 结果37-39
• 2.1 JH信号通路基因在桔小实蝇不同发育阶段的表达模式37-38
• 2.2 JH信号通路基因在桔小实蝇不同组织的表达模式38-39
• 3 讨论39-41
• 第四章 JH III及METHOPRENE对桔小实蝇JH信号通路基因表达的影响41-49
• 1 材料和方法41-43
• 1.1 供试昆虫41
• 1.2 实验试剂及仪器41
• 1.3 激素处理41-42
• 1.4 总RNA提取42
• 1.5 cDNA合成42
• 1.6 引物设计和合成42
• 1.7 实时定量PCR42-43
• 1.8 数据分析43
• 2 结果43-46
• 2.1 外源激素对桔小实蝇幼虫的影响43-44
• 2.2 外源激素对桔小实蝇蛹的影响44-46
• 3 讨论46-49
• 第五章 桔小实蝇MET和KR-H1基因功能分析49-57
• 1 材料和方法49-54
• 1.1 供试昆虫49
• 1.2 实验试剂及仪器49
• 1.3 dsRNA引物设计49-50
• 1.4 dsRNA合成50-53
• 1.5 dsRNA检测53
• 1.6 dsRNA饲喂53
• 1.7 RNA干扰水平检测和表型观察53-54
• 2 结果54-56
• 2.1 dsRNA合成54
• 2.2 沉默效率54-55
• 2.3 表型变化55-56
• 3 讨论56-57
• 第六章 主要结论和展望57-59
• 1 主要结论57
• 2 展望57-59
• 参考文献59-67
• 在读期间发表论文情况67-69
• 致谢69

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1 龚秀泽,白志良,林树端;凭祥局多次从越南边贸入境的水果中截获桔小实蝇[J];植物检疫;2001年02期

2 李萍;东兴局多次在越南水果中截获桔小实蝇[J];植物检疫;2001年03期

3 张承运 ,滕丙|，

本文编号：750402