生防芽孢杆菌的筛选及其抗菌物质的分离纯化与鉴定

发布时间：2017-09-06 10:10

  本文关键词：生防芽孢杆菌的筛选及其抗菌物质的分离纯化与鉴定

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【摘要】：农作物病害是一个全球性的难题,它给人类带来了巨大的经济损失。农作物病害主要是由真菌引起的。农作物病害的生物防治是利用有益微生物或微生物代谢产物对农作物病害进行有效防治的技术与方法。芽孢杆菌的诸多优势如高抗逆、分布广、生长快等特点在生物防治中受到越来越多的关注。本实验从筛选芽孢杆菌的目的出发,从黑龙江省凉水国家级自然保护区林下土壤中筛选芽孢杆菌,经过反复纯化,得到几十株芽孢杆菌。以植物病原真菌为靶标菌株,对所筛选得到的芽孢杆菌初筛和复筛,最终挑选出3株抑菌活性强的生防芽孢杆菌并保藏。从形态学鉴定、生理生化鉴定,菌株16SrDNA序列的测定三个方面对所筛选得到3株生防芽孢杆菌进行了鉴定,经鉴定,拮抗芽孢杆菌F1、F17和H1分别是短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对所筛选得到的拮抗菌株的拮抗机理进行了初步研究,发现所筛选出的拮抗芽孢杆菌F1、F17和H1的发酵代谢产物对植物病原菌都有明显抑制作用,可以初步判定筛到的拮抗芽孢杆菌F1、F17和H1都是通过发酵液中胞外分泌物对植物病原菌起到的抑菌作用,且同种拮抗芽孢杆菌对不同的植物病原菌有明显不同的抑制效果。且经过高温处理后,拮抗芽孢杆菌菌株F1、H1的发酵液仍然具有很明显的抑菌活性,而拮抗芽孢杆菌菌株F17经高温处理后,其无菌发酵液里的抗菌物质失活。利用饱和度为60%的硫酸铵沉淀短小芽孢杆菌F1的无菌发酵液,得到粗蛋白,然后经DEAE-Sepharose阴离子交换层析后,用不同浓度梯度的NaCl洗脱,其中用0.35 mol/L NaCl洗脱的组分具有抑菌活性。将具有抑菌活性的蛋白进行通过SDS-PAGE进行观察,发现该抑菌蛋白的分子量约为36.0 kDa。将得到的抗菌蛋白进行121℃处理30 min后,发现该蛋白仍然具有明显的抑菌活性。本文筛选得到了具有抑菌作用的芽孢杆菌,并初步分离纯化得到抗菌蛋白,为今后的研究奠定了基础,将为其应用于生物防治起着非常重要的作用。
【关键词】：生物防治 短小芽孢杆菌F1 枯草芽孢杆菌H1 抑菌机理
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第1章 绪论10-21
• 引言10
• 1.1 课题来源10
• 1.2 课题背景及研究的目的和意义10-16
• 1.2.1 植物病害的防治方法10-14
• 1.2.2 芽孢杆菌的主要特征14-15
• 1.2.3 芽孢杆菌的分类15
• 1.2.4 芽孢杆菌的应用15-16
• 1.3 研究现状16-18
• 1.3.1 拮抗枯草芽孢杆菌生物防治国内外研究现状16-17
• 1.3.2 拮抗短小芽孢杆菌生物防治国内外研究现状17-18
• 1.4 国内外文献综述的简析18
• 1.5 课题研究目的及意义18-19
• 1.6 课题主要研究内容及技术路线19-21
• 第2章 实验材料与方法21-29
• 2.1 实验材料21-23
• 2.1.1 实验仪器21-22
• 2.1.2 实验菌种及培养基22
• 2.1.3 实验药品与试剂22-23
• 2.2 实验方法23-29
• 2.2.1 培养基23
• 2.2.2 植物根际土壤中芽孢杆菌的分离、纯化及拮抗菌的筛选23-24
• 2.2.3 拮抗菌株形态、生理生化及分子鉴定24-26
• 2.2.4 拮抗活性的测定26
• 2.2.5 拮抗菌株的拮抗机理初步研究26-27
• 2.2.6 拮抗菌株所产抗菌物质初步分离纯化27-29
• 第3章 生防芽孢杆菌的筛选与鉴定29-37
• 引言29
• 3.1 芽孢杆菌的初步分离及纯化29-30
• 3.2 拮抗芽孢杆菌的初筛30-31
• 3.3 拮抗芽孢杆菌的复筛31-32
• 3.4 拮抗芽孢杆菌的鉴定32-36
• 3.4.1 形态观察结果32-33
• 3.4.2 菌株 16SrDNA序列的测定结果33-34
• 3.4.3 生理生化鉴定结果34-36
• 3.5 本章小结36-37
• 第4章 拮抗菌株的拮抗机理初步研究37-43
• 引言37
• 4.1 拮抗菌株生长曲线的测定37-38
• 4.2 拮抗菌株发酵液抑菌作用的测定38-40
• 4.3 发酵液超滤分离后抑菌活性的测定40-41
• 4.4 发酵液高温处理后抑菌活性的测定41
• 4.5 本章小结41-43
• 第5章 拮抗菌株F1抗菌蛋白的分离纯化及鉴定43-48
• 引言43
• 5.1 拮抗菌株F1抗菌蛋白的提取43-44
• 5.2 DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析44
• 5.3 洗脱组分抑菌活性的测定44-45
• 5.4 抗菌蛋白浓度的测定45-46
• 5.5 抗菌蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）46
• 5.6 拮抗菌株所产抗菌物质的热稳定性检测46-47
• 5.7 本章小结47-48
• 结论48-49
• 参考文献49-56
• 致谢56

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本文编号：802504