蝗绿僵菌MabrlA在产孢调控作用和致病机制中的功能研究

发布时间：2017-09-09 23:23

  本文关键词：蝗绿僵菌MabrlA在产孢调控作用和致病机制中的功能研究

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【摘要】：昆虫病原真菌在农业害虫防治中作为重要的杀虫真菌,其分生孢子是杀虫真菌类农药的主要有效作用单元。因此,研究昆虫病原真菌产孢调控,对于提高孢子产率和孢子质量,进而促进杀虫真菌农药应用具有重要作用。brlA编码一种C2H2型锌指转录调控因子,在丝状真菌产孢和菌丝生长调控中起着中心调控作用,与abaA和wet A共同组成调控产孢特异基因表达的brlA-abaA-wetA中心途径。在构巢曲霉中,敲除该基因后产孢功能丧失,菌丝呈短而硬的毛发状。但是,在蝗绿僵菌中其功能没阐明。本文实验材料采用昆虫病原真菌蝗绿僵菌,通过同源重组方法构建基因敲除菌株和回复菌株对该基因的功能进行研究。主要研究结果如下:1.利用蝗绿僵菌全基因序列数据库和全基因组文库,克隆得到MabrlA全长cDNA序列与构建敲除载体所用的左右臂(800bp以上)序列;构建MabrlA基因敲除载体和回复载体,进行蝗绿僵菌的遗传转化,筛选得到目标转化子;2.MabrlA的缺失影响蝗绿僵菌的产孢、抗逆特性和毒力。平板菌落和显微观察表明:敲除MabrlA后,蝗绿僵菌产孢减少(菌落生长减弱、产孢延迟、分枝数减少);逆境敏感性测定结果表明:敲除MabrlA孢子耐受性降低。经UV-B照射处理,ΔMabrlA菌株的半抑制萌发时间比WT和CP的半抑制萌发时间提前2.8h;热激处理后,ΔMabrlA菌株的半抑制萌发时间比WT和CP的半抑制萌发时间提前1.7h。在添加细胞壁破坏剂的培养基上,ΔMabrlA菌株耐受性降低。ΔMabrlA菌株细胞壁厚度极显著增厚。3.在蝗绿僵菌中,利用定量PCR技术,分别测定MaflbA、MaflbC、Maste12、MabrlA、MafluG、MafadA和MawetA敲除突变菌株中其它产孢调控基因的表达水平,确定两条调控途径:由fluG-flbs产孢调控途径和Fad A(Gα)产孢调控途径共同调控产孢,brlA处于调控途径的关键位置,flbB和flbC双向调控产孢;4.蝗绿僵菌MabrlA调控孢子细胞壁主要成分的含量和分布,从而影响其抗逆特性。荧光染料染色总甘露聚糖,发现ΔMabrlA菌株孢子表面暴露出来的总甘露糖的荧光强度弱于WT,ΔMabrlA菌株孢子表面暴露出来的壳聚糖的荧光强度弱于WT,ΔMabrlA菌株的β-1,3-葡聚糖荧光强度与WT无差异;ΔMabrlA菌株菌丝表面暴露出来的壳聚糖分布不均匀。提取细胞壁组成分析,ΔMabrlA菌株的几丁质含量是野生型的三倍,甘露糖蛋白是野生型菌株的30%,而葡聚糖含量与野生型相差不大。5.蝗绿僵菌MabrlA缺失导致东亚飞蝗体液免疫、细胞免疫反应增强,是其毒力丧失的重要机制。经ΔMabrlA菌株处理的蝗虫不死亡,ΔMabrlA菌株的附着胞形成率显著少于WT、附着胞的膨压降低。附着胞穿透体表过程中,ΔMabrlA菌株的水解蛋白酶Pr1和Chi上调表达;ΔMabrlA菌株在蝗虫体内不生长;ΔMabrlA菌株的黑化作用加强、酚氧化酶活性提高;血细胞和脂肪体中TOLL通路免疫信号基因Lmspatzle、Lmcactus上调表达,增强寄主的免疫,抵抗真菌的侵染。在蝗绿僵菌中的作用,特别是MabrlA对蝗绿僵菌细胞壁成分的含量和分布的影响,进一步影响蝗绿僵菌的抗逆特性和侵染致病能力,研究昆虫病原真菌产孢调控机制和侵染致病的分子机制,对充分挖掘其在生物防治中的潜力,具有十分重要的理论意义和实际应用价值。
【关键词】：蝗绿僵菌 C2H2型锌指转录调控因子 基因敲除 产孢 侵染致病能力
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S476.1
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-9
• 1 绪论9-16
• 1.1 引言9
• 1.2 研究背景9-13
• 1.2.1 昆虫病原真菌产孢研究进展9-10
• 1.2.2 昆虫病原真菌的致病机制10-12
• 1.2.3 丝状真菌产孢分子研究进展12-13
• 1.3 立题依据及研究目的13-14
• 1.4 研究内容14
• 1.5 实验技术路线14-15
• 1.6 本项目的特色与创新之处15-16
• 2 蝗绿僵菌MabrlA的功能分析16-62
• 2.1 主要材料16-20
• 2.1.1 供试菌株和昆虫16
• 2.1.2 质粒载体16
• 2.1.3 主要培养基、实验溶液16-18
• 2.1.4 主要试剂18-19
• 2.1.5 主要设备19-20
• 2.2 主要方法20-35
• 2.2.1 连接产物转化大肠杆菌感受态细胞20
• 2.2.2 根癌农杆菌AGL-1 感受态细胞的制备及电转化20-21
• 2.2.3 农杆菌介导的蝗绿僵菌的转化21-22
• 2.2.4 微量提取真菌的基因组22
• 2.2.5 基因全长比对及cDNA ORF全长克隆22-23
• 2.2.6 MabrlA基因的生物信息学分析23-24
• 2.2.7 MabrlA基因的敲除、回复表达载体构建24-26
• 2.2.8 敲除菌株、回复菌株的初步筛选验证26-27
• 2.2.9 Southern blot验证MabrlA敲除、回复菌株27-29
• 2.2.10 MabrlA对蝗绿僵菌生长与产孢的影响29-30
• 2.2.11 MabrlA对蝗绿僵菌孢子特性的影响30
• 2.2.12 MabrlA对蝗绿僵菌孢子细胞壁的影响30-33
• 2.2.13 MabrlA调控蝗绿僵菌产孢的途径33
• 2.2.14 毒力实验分析33-35
• 2.3 实验结果与分析35-58
• 2.3.1 生物信息学分析MabrlA基因35-37
• 2.3.2 MabrlA重组载体的构建及转化菌株验证37
• 2.3.3 MabrlA对蝗绿僵菌生长与产孢的影响37-41
• 2.3.4 MabrlA对蝗绿僵菌孢子特性的影响41-44
• 2.3.5 MabrlA对蝗绿僵菌孢子细胞壁的影响44-48
• 2.3.6. MabrlA调控蝗绿僵菌产孢的途径48-51
• 2.3.7 MabrlA对蝗绿僵菌致病性的影响51-58
• 2.4 讨论58-62
• 3 主要结论和后续工作建议62-64
• 3.1 主要研究结论62
• 3.2 后续试验建议62-64
• 致谢64-66
• 参考文献66-74
• 附录74-75
• A 作者在攻读硕士学位期间发表论文的目录74-75
• B 序列75

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本文编号：823369