啶虫脒讲解菌株的分离、鉴定及腈水合酶基因的克隆与表达

发布时间：2017-09-12 14:26

  本文关键词：啶虫脒讲解菌株的分离、鉴定及腈水合酶基因的克隆与表达

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【摘要】：啶虫脒是一种广谱新烟碱类杀虫剂,也是一种新型的农药,现已经被越来越多的国家投入使用,而我国啶虫脒的年产量已超过了5000吨。啶虫脒是一种具有一定杀螨活性的杀虫剂,其作用于土壤和枝叶的系统。广泛用于水稻,尤其蔬菜、果树、茶叶的蚜虫、飞虱、蓟马、部分鳞翅目害虫等的防治。但作为杀虫剂它仍具有低毒性,并且在生态系统中被广泛的检测到,在这个越来越重视生态的社会中,引起了广泛的关注。啶虫脒污染的生物修复被认为是一种有效、可靠和无再次污染的方法。因此,筛选高效降解啶虫脒的微生物菌种资源,探索其降解啶虫脒的作用机理,充分发挥其降解能力,具有重大的理论意义和实际应用价值。本实验研究的意义在于分离、筛选高效降解啶虫脒的微生物菌株,并对菌株在不同环境条件下降解啶虫脒的特性进行研究,以期为啶虫脒污染环境的修复提供理论依据;同时克隆降解啶虫脒的关键酶基因,进一步研究该降解酶的特性。本文通过富集培养的方法,从被啶虫脒污染的土样中筛选出5株啶虫脒降解菌株,分别命名为22-5、DF-1、Y-3、DY-17、YF-20。选取其中降解啶虫脒效果最好的一株菌DY-17作为研究对象,通过革兰氏染色及在电镜下的照片确定其为一株革兰氏阴性的杆菌。采用SDS高盐法从啶虫脒降解菌DY-17中提取高质量的染色体总DNA,作为模板通过16S rRNA基因系统发育分析初步鉴定为Pseudomonas sp.中的一个新成员,并根据比对结果构建系统发育树。对啶虫脒降解菌DY-17的生理特性进行研究,得出啶虫脒降解菌株DY-17降解活性的最适条件为:37℃,pH为7,啶虫脒浓度为200 mg/L;该研究结果为啶虫脒污染环境的生物修复提供了菌种资源。将所提取的细菌总DNA,建立基因组文库。约从12000个转化子中筛选出了一个具有啶虫脒降解活性的阳性克隆子。用软件分析确定了其为腈水合酶结构基因。将啶虫脒的腈水合酶结构基因和腈水合酶结构基因下游的激活蛋白连接到表达载体pET29a上,再分别将腈水合酶和腈水合酶与激活蛋白转化到Ecoli.BL21(DE3)表达;进行SDS-PAGE分析,从电泳图我们获得了腈水合酶结构基因的α亚基大小为26 kDa,β亚基大小为25 kDa,激活蛋白分子大小为48kDa。从实验中我们可以得出:啶虫脒降解菌株腈水合酶基因单独表达时活性较低,以可溶性表达的量比较少,酶的活性较弱;当与激活蛋白共表达时,以可溶性表达的量增加,酶的活性增强,说明激活蛋白可能起着类似分子伴侣的作用,帮助腈水合酶正确折叠,形成有功能的空间构象。这将为新烟碱类杀虫剂污染的微生物修复提供基础。
【关键词】：啶虫脒 降解 生物修复 腈水合酶 激活蛋白 分子伴侣
【学位授予单位】：淮北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X592;X172
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-12
• 第一章 啶虫脒及其在环境中的代谢转化12-18
• 1 啶虫脒的主要物理化学性质及其用途12-13
• 2 啶虫脒的作用机制13
• 3 啶虫脒的性能特点13-14
• 4 啶虫脒的残留14
• 5 啶虫脒在环境中的代谢转化14-16
• 5.1 啶虫脒的光解14-15
• 5.2 啶虫脒的水解15-16
• 5.3 啶虫脒在土壤中的降解16
• 6 啶虫脒微生物降解研究存在的问题及发展的方向16-18
• 第二章 啶虫脒降解菌株的分离、鉴定及其生理特性研究18-39
• 第一节 啶虫脒降解菌株的分离与鉴定18-32
• 1 材料与方法18-26
• 1.1 菌株、培养基、试剂与仪器18-19
• 1.2 啶虫脒检测方法的测定19-20
• 1.3 啶虫脒降解菌株的分离与筛选20
• 1.4 降解菌株的革兰氏染色20-21
• 1.5 降解菌株的抗性筛选21-22
• 1.6 啶虫脒降解菌株的培养特征及生理生化鉴定22
• 1.7 啶虫脒降解菌株 16S r RNA基因序列的分析22-25
• 1.8 啶虫脒降解菌株 16S rRNA基因的PCR扩增25
• 1.9 啶虫脒降解菌株系统发育树构建25-26
• 2 结果与分析26-31
• 2.1 啶虫脒检测方法的测定26-27
• 2.2 啶虫脒降解菌株的分离与筛选27-28
• 2.3 啶虫脒降解菌株的初步鉴定28-29
• 2.4 革兰氏染色结果29
• 2.5 啶虫脒降解菌株的抗性筛选29-30
• 2.6 啶虫脒降解菌株的 16s rRNA基因序列的分析30-31
• 3 小结31-32
• 第二节 啶虫脒降解特性研究32-39
• 1 材料与方法32-35
• 1.1 培养基与菌株32
• 1.2 主要试剂和仪器32-33
• 1.3 生长曲线及降解测定33
• 1.4 温度对菌株DY-17降解率的影响33
• 1.5 初始pH值对菌株DY-17降解率的影响33
• 1.6 培养液初始农药浓度对菌株DY-17降解率的影响33-34
• 1.7 金属离子对菌株DY-17降解率的影响34-35
• 2 结果与分析35-38
• 2.1 菌株DY-17的生长和降解曲线35-36
• 2.2 温度对菌株DY-17降解率的影响36
• 2.3 初始pH对菌株DY-17降解率的影响36-37
• 2.4 培养液初始农药浓度对菌株DY-17降解率的影响37-38
• 2.6 金属离子对菌株DY-17降解率的影响38
• 3 小结38-39
• 第三章 啶虫脒腈水合酶的克隆与表达39-67
• 第一节 啶虫脒腈水合酶基因的克隆与表达40-58
• 1 材料与方法40-49
• 1.1 菌株及质粒40
• 1.2 试剂40
• 1.3 培养基40-41
• 1.4 超级感受态的制备41-43
• 1.5 细菌总DNA的提取43
• 1.6 质粒DNA的少量提取43
• 1.7 基因组总DNA的Sau3AI部分酶切与片段回收43-44
• 1.8 酶连44-45
• 1.9 酶连产物的转化45
• 1.10 阳性克隆子的筛选45
• 1.11 序列测定45
• 1.12 基因序列的比较与分析45
• 1.13 啶虫脒腈水合酶结构基因的PCR扩增45-46
• 1.14 啶虫脒腈水合酶表达载体的构建46-47
• 1.15 啶虫脒腈水合酶的SDS-PAGE分析47-49
• 2 结果与分析49-57
• 2.1 Sau3AI部分酶切49
• 2.2 菌株DY-17总DNA文库的构建49-50
• 2.3 阳性克隆子的筛选50-51
• 2.4 基因序列的测定及分析51-53
• 2.5 结构基因的表达53-57
• 3 讨论57-58
• 第二节 激活蛋白的克隆与腈水合酶及其激活蛋白共表达58-67
• 1 材料与方法58-62
• 1.1 菌株及质粒58
• 1.2 试剂58-59
• 1.3 培养基59
• 1.4 啶虫脒腈水合酶的激活蛋白结构基因的PCR扩增59-60
• 1.5 啶虫脒腈水合酶的激活蛋白表达载体的构建60
• 1.6 表达60-62
• 2 结果与分析62-66
• 2.1 啶虫脒腈水合酶激活蛋白结构基因的扩增及分析62
• 2.2 表达载体的构建62-63
• 2.3 啶虫脒腈水合酶激活蛋白结构基因在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE分析63-64
• 2.4 啶虫脒腈水合酶结构基因及其激活蛋白结构共表达的SDS-PAGE分析64-65
• 2.5 啶虫脒腈水合酶及其激活蛋白共表达质粒的功能验证65-66
• 3 讨论66-67
• 参考文献67-72
• 附录72-77
• 攻读硕士学位期间出版或发表的论著、论文77-78
• 致谢78

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本文编号：837775