鸡羽毛降解菌株的分离鉴定及其发酵条件和降解效果的研究

发布时间：2017-09-17 15:12

  本文关键词：鸡羽毛降解菌株的分离鉴定及其发酵条件和降解效果的研究

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【摘要】：羽毛是重要的蛋白质资源,其蛋白含量在80%以上,主要成分为角蛋白。但由于角蛋白是一种具有极强抗性,难以生物降解的硬蛋白,难以直接利用,而传统的物理和化学加工方法不仅消耗大量能源,还引发严重的二次污染问题。目前我国养殖业中每年产生百万余吨羽毛废弃物,且其数量还将增长,随着蛋白资源紧缺程度的加剧和我国经济的发展,亟需实现废弃角蛋白的高值转化和循环利用,而微生物降解羽毛角蛋白既能对羽毛废弃物进行无害化处理,又能实现角蛋白资源的转化利用,从而实现羽毛废弃物的变废为宝,这将产生巨大的生态效益和经济效益。本研究首先采用以酪蛋白为唯一碳氮源的筛选培养基和以羽毛为唯一碳氮源的发酵培养基对能够降解羽毛的细菌进行初筛和复筛,以筛选培养基中酪蛋白降解圈和发酵培养基中羽毛是否降解作为判定依据,从下水道、掩埋家禽尸体的泥土、花坛、鱼塘等环境中分离和筛选出八株能高效降解羽毛的菌株:F-T1-2、X1、D1、T1、T3、Y2、T2、B1-2。通过形态学观察、生化鉴定试验和16S rDNA序列测定及系统发育分析,最终判定:F-T1-2、T1、T3为蜡样芽胞杆菌,X1、D1为甜菜假单胞菌,Y2、T2为嗜麦芽寡养单胞菌,B1-2为铜绿假单胞菌。并测得各菌株发酵降解羽毛24 h发酵上清液粗酶液的角蛋白酶酶活力为T1:49.9 U/mL,T3:34.3 U/mL,F-T1-2:32.05U/mL,D1:23.1 U/mL,X1:35.6 U/mL,Y2:35.45 U/mL,T2:28.65 U/mL。迄今为止,国内外暂无甜菜假单胞菌、国内暂无铜绿假单胞菌降解角蛋白的报道,本研究为首次报道。以1%的羽毛为底物,测定菌株D1、T2、Y2、T3、B1-2、F-T1-2对羽毛的降解效率,进行了发酵条件的初步优化,确定最佳发酵初始pH值分别为:D1和T2为pH=10,T3和B1-2为pH=11,Y2为pH=9,F-T1-2为pH=7;最佳发酵培养温度分别为:D1和T2为27℃,F-T1-2、B1-2和Y2为37℃,T3为32℃。通过肉眼观察各菌株降解羽毛过程中羽毛结构变化和发酵液性状变化,并对F-T1-2降解的羽毛进行分时取样和扫描电镜观察。肉眼观察和电镜扫描显示发酵24h时,部分羽小枝脱落,部分羽枝脱落,羽毛梗表面鳞片结构开始脱落;发酵48h时,大部分羽小枝断裂脱落,大部分羽枝脱落,羽毛梗鳞片下纤维结构暴露;发酵72h,羽枝剧烈断裂,羽小枝几乎消失,羽毛梗纤维撕裂、凹陷,羽毛梗内部蜂巢结构暴露;发酵192h,羽枝和羽小枝已完全降解,羽毛梗断裂、分离,内部蜂巢结构完全暴露并开始溶解;发酵液随着发酵时间延长变得褐色浑浊。因此推断羽毛各部位的降解速度和容易程度顺序为:羽小枝羽枝羽毛梗;简要概括羽毛的降解过程为:羽毛降解菌附着→羽小枝完全降解→羽枝完全降解→羽毛梗完全降解。本研究分离获得了八株高效的羽毛角蛋白降解菌,丰富了角蛋白降解菌的研究内容,为将来规模化的羽毛降解、大量的角蛋白酶生产纯化,甚至为重组基因工程菌株、构建高效生产菌株、开发新型蛋白酶品种打下基础。
【关键词】：角蛋白降解菌株 分离 鉴定 发酵条件 羽毛降解
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X172;X713
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 缩写词与英汉对照7-11
• 1 前言11-18
• 1.1 羽毛及角蛋白的结构与特性11-12
• 1.2 角蛋白降解菌的分类12-13
• 1.3 角蛋白酶的分类13-14
• 1.4 角蛋白的降解机制14-16
• 1.4.1 物理压力理论14-15
• 1.4.2 硫解理论15
• 1.4.3 酶解理论15-16
• 1.5 羽毛角蛋白降解菌的分离与鉴定方法16-17
• 1.5.1 羽毛的处理与培养基的制备16
• 1.5.2 角蛋白降解菌的分离筛选16
• 1.5.3 菌株形态观察和生理生化性质鉴定16-17
• 1.5.4 16S rDNA测定和系统发育树分析17
• 1.6 本研究的目的与意义17-18
• 2 材料和方法18-24
• 2.1 材料18-19
• 2.1.1 羽毛的制备18
• 2.1.2 主要试剂18
• 2.1.3 主要仪器设备18
• 2.1.4 培养基18-19
• 2.1.5 实验常用器械与耗材19
• 2.2 羽毛降解菌的分离、筛选和角蛋白酶酶活力测定19-20
• 2.2.1 样品采集与富集培养19
• 2.2.2 羽毛降解菌的分离、筛选19
• 2.2.3 细菌生长速率测定19
• 2.2.4 角蛋白酶酶活力测定19-20
• 2.3 羽毛降解菌的菌种鉴定20-21
• 2.3.1 菌落和菌体的形态观察20
• 2.3.2 生化特性鉴定20
• 2.3.3 细菌 16S rDNA序列测定与分析20-21
• 2.3.4 系统发育分析21
• 2.4 羽毛降解菌发酵条件的研究21-24
• 2.4.1 初始pH对羽毛降解的影响21-23
• 2.4.2 培养温度对羽毛降解的影响23-24
• 2.5 羽毛降解过程的研究24
• 2.5.1 已降解与未降解羽毛的眼观结构对比24
• 2.5.2 各菌株完全降解羽毛的时间24
• 2.5.3 羽毛降解过程中的显微结构变化24
• 3 结果与分析24-60
• 3.1 筛选结果24-27
• 3.1.1 初筛平板生长状况24-25
• 3.1.2 复筛发酵结果25-26
• 3.1.3 细菌生长速率测定结果26
• 3.1.4 角蛋白酶酶活力测定结果26-27
• 3.2 菌种鉴定结果27-39
• 3.2.1 菌株平板生长特征27-29
• 3.2.2 细菌菌体显微形态29-31
• 3.2.3 细菌生化鉴定结果31-32
• 3.2.4 细菌 16S rDNA分析32-39
• 3.3 羽毛降解菌发酵条件的研究结果39-53
• 3.3.1 初始pH对羽毛降解的影响39-47
• 3.3.2 培养温度对羽毛降解的影响47-53
• 3.4 发酵过程中羽毛的降解效果53-60
• 3.4.1 已降解与未降解羽毛的眼观结构对比53
• 3.4.2 各菌株完全降解羽毛的时间53-55
• 3.4.3 羽毛降解过程中的显微结构变化55-60
• 4 讨论60-63
• 4.1 角蛋白降解菌株的分离与鉴定60-61
• 4.2 培养条件对羽毛降解的影响61-62
• 4.2.1 初始pH值对羽毛降解的影响61
• 4.2.2 培养温度对羽毛降解的影响61-62
• 4.3 角蛋白降解菌降解羽毛的效果62-63
• 5 结论63-64
• 致谢64-65
• 参考文献65-69
• 附录 各分离菌株 16S rDNA序列69-74

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