苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

发布时间：2017-09-18 08:03

  本文关键词：苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆与原核表达研究

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【摘要】：【目的】丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)是以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶。在昆虫中,丝氨酸蛋白酶参与消化、发育、先天免疫反应和组织重建等重要的生理过程。本试验以苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca为材料,克隆其丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,再对该基因进行原核表达并对表达产物进行活性测定研究。【方法】从苜蓿夜蛾中肠中提取总RNA,通过RT-PCR和RACE技术,扩增获得丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列,用大肠杆菌E.coli表达系统进行表达;再对表达的重组蛋白进行变性、纯化与复性,并以BTEE为底物进行活性测定。【结果】克隆得到的苜蓿夜蛾中肠丝氨酸蛋白酶基因命名为Hv SP,该基因已登录Gen Bank,登录号为KT907053。该基因全长1 017 bp,开放阅读框为886 bp,编码295个氨基酸,分子量约为30.8 ku,等电点为8.27,推导的氨基酸序列与其他昆虫丝氨酸蛋白酶氨基酸序列相似性在46%~92%之间。在Tris-HCl缓冲液中,p H为8.5时,复性的重组蛋白活性最高,为28.7 U/m L。荧光定量PCR结果表明,Hv SP基因的m RNA在苜蓿夜蛾的多个组织中特异性表达,且在中肠中表达量最高,但在唾腺中未检测到Hv SP的m RNA表达。【结论】该研究克隆了一个新的苜蓿夜蛾丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列,且原核表达后的重组蛋白经过变性、纯化及复性后具有活性,为进一步探索丝氨酸蛋白酶在昆虫体内的生理生化功能奠定了基础。
【作者单位】： 东北农业大学农学院;
【关键词】： 苜蓿夜蛾 丝氨酸蛋白酶 克隆 原核表达 酶活性
【基金】：国家现代农业产业技术体系建设专项基金CARS-04
【分类号】：S433.4
【正文快照】： **第一作者First author,E-mail:leelily201@163.com***通讯作者Corresponding author,E-mail:dnfd@163.com丝氨酸蛋白酶(Serine protease,SP)超家族是一类在C端具有特异性保守催化三联体(His、Asp、Ser)结构域的蛋白水解酶,广泛存在于生物有机体中(Ross et al.,2003)。该家族

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1 慕卫,吴孔明,梁革梅,张文吉;苜蓿夜蛾人工饲养技术[J];农药学学报;2002年01期

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本文编号：874322