象耳豆根结线虫MeCPI基因的分离与鉴定

发布时间：2017-09-21 06:13

  本文关键词：象耳豆根结线虫MeCPI基因的分离与鉴定

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【摘要】：象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)寄主范围广,繁殖率高,致病力强,可寄生携带Mi抗性基因的番茄(Solanum lycopersicum)和辣椒(Capsicum frutescens)。如今,象耳豆根结已成为全球热带、亚热带地区作物的一个重要病原物。该线虫在我国南方地区分布较广,且严重危害多种作物,目前已在20多种经济作物及多种热带水果上分离到该线虫。象耳豆根结线虫在其寄生过程中,向寄主植物细胞中分泌多种由线虫食道腺细胞表达的效应子蛋白,分离和鉴定这些效应子蛋白的功能有助于理解象耳豆根结线虫的分子致病机理。本文通过同源克隆的方法,克隆到象耳豆根结线虫的一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因MeCPI,并通过原位杂交、龄期表达、体外RNAi和瞬时表达等方法,初步分析了MeCPI的功能。1.经同源克隆得到了象耳豆根结线虫的MeCPI基因。该基因的cDNA全长为444bp,DNA全长为1543bp,含有4个内含子。MeCPI基因编码的蛋白质含有147个氨基酸残基,用SignalP预测该蛋白含有信号肽序列。该蛋白含有一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白保守结构域。2.通过原位杂交的技术,研究了MeCPI基因在象耳豆根结线虫侵染前二龄幼虫中的定位。结果显示,该基因在象耳豆根结线虫的背食道腺部位表达。3.qRT-PCR结果表明,MeCPI基因在四龄幼虫阶段表达量最高,在三龄幼虫阶段也有较高的表达量,而在卵和侵染前二龄幼虫阶段表达量非常低。表明MeCPI基因的功能与象耳豆根结线虫的寄生有关。4.通过体外浸泡法沉默MeCPI基因后,发现相对于用ddH2O处理的对照组,实验组的成熟雌虫数量明显减少,同样说明MeCPI基因的功能与象耳豆根结线虫的寄生有关。5.通过烟草瞬时表达MeCPI基因,用Western-blot检测到该基因cDNA全长和去信号肽片段所表达的蛋白,为后续实验提供可参考的依据。
【关键词】：象耳豆根结线虫 效应子蛋白 MeCPI 原位杂交 RNAi
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S432.45
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 缩写词及英文对照6-10
• 1 前言10-20
• 1.1 根结线虫及其危害10
• 1.2 根结线虫的生活史10-12
• 1.3 根结线虫的防治12
• 1.4 植物寄生线虫效应子蛋白的研究概况12-15
• 1.4.1 植物寄生线虫的效应子蛋白12-13
• 1.4.2 降解或修饰细胞壁13
• 1.4.3 参与调控寄主细胞代谢和信号途径13-14
• 1.4.4 抑制寄主的防卫反应14-15
• 1.4.5 半胱氨酸蛋白酶抑制剂蛋白的研究概况15
• 1.5 植物寄生线虫效应蛋白功能的研究方法15-19
• 1.5.1 常用研究方法概述15
• 1.5.2 RNAi在植物寄生线虫研究中的应用15-17
• 1.5.3 原位杂交技术和龄期表达17-18
• 1.5.4 瞬时表达18
• 1.5.5 酵母双杂交18-19
• 1.6 研究目的及内容19-20
• 2 材料与方法20-41
• 2.1 材料20-22
• 2.1.1 供试线虫种群和植物20
• 2.1.2 菌株及载体20
• 2.1.3 主要试剂及试剂盒20
• 2.1.4 主要溶液配方20-21
• 2.1.5 主要培养基配方21
• 2.1.6 主要仪器21-22
• 2.2 方法22-41
• 2.2.1 象耳豆根结线虫总RNA的提取22
• 2.2.2 象耳豆根结线虫基因组DNA的提取22-23
• 2.2.3 象耳豆根结线虫MeCPI基因cDNA的获得23
• 2.2.4 象耳豆根结线虫Me-CPI基因EST序列的获得23-28
• 2.2.5 MeCPI基因在象耳豆根结线虫不同发育阶段的表达量分析28-31
• 2.2.6 MeCPI基因的体外RNAi31-33
• 2.2.7 MeCPI基因的原位杂交33-35
• 2.2.8 瞬时表达35-41
• 3 结果41-51
• 3.1 MeCPI基因的克隆及序列分析41-45
• 3.2 原位杂交45-46
• 3.2.1 杂交探针的合成45
• 3.2.2 原位杂交结果45-46
• 3.3 MeCPI基因在象耳豆根结线虫不同发育阶段表达量的分析46-47
• 3.4 体外浸泡RNAi47-49
• 3.4.1 MeCPI基因dsRNA的合成47-48
• 3.4.2 qRT-PCR对MeCPI沉默效果的检测48-49
• 3.4.3 体外RNAi对象耳豆根结线虫侵染力的影响49
• 3.5 MeCPI基因的烟草瞬时表达49-51
• 3.5.1 植物表达载体的构建49
• 3.5.2 工程农杆菌的PCR鉴定49-50
• 3.5.3 Western-blot检测50-51
• 4 结论与讨论51-55
• 4.1 结论51
• 4.2 讨论51-55
• 4.2.1 MeCPI基因的克隆51-52
• 4.2.2 MeCPI基因的定位与龄期表达52
• 4.2.3 MeCPI基因的体外RNAi52-53
• 4.2.4 MeCPI基因的瞬时表达53-54
• 4.2.5 本研究需进一步解决的问题54-55
• 致谢55-56
• 参考文献56-60
• 附录60-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 扈丽丽;卓侃;林柏荣;廖金铃;;植物寄生线虫效应蛋白功能分析方法的研究进展[J];中国生物工程杂志;2016年02期

2 牛俊海;郭仰东;简恒;;RNA干扰在植物抗根结线虫病基因工程应用中的研究进展[J];基因组学与应用生物学;2009年01期

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本文编号：892831