高产D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的分析、食品级诱导表达及其酶学性质的研究

发布时间：2020-11-19 21:43

　　 L-阿拉伯糖异构酶(L-Arabinose Isomerase,L-AI)是生物法异构化D-半乳糖为D-塔格糖的关键酶。本研究从腌菜和泡菜中分离出一批乳酸菌,经纸色谱法初筛和改良半胱氨酸咔唑法复筛,获得1株粗酶酶活达13.95U/m L的高产D-塔格糖的乳酸菌,通过NCBI进行16S rDNA序列比对及生化特征分析,鉴定其为植物乳杆菌并命名为WU14。上传这株菌株部分16S rDNA基因序列至NCBI基因库,获得Genbank序列登入号:KJ918744。根据菌种特异性及基因保守性设计L-阿拉伯糖异构酶基因引物,通过PCR扩增得到这株菌株的L-阿拉伯糖异构酶基因,对这株菌株的L-阿拉伯糖异构酶基因进行TA克隆并上传该段基因序列至Genbank。此外,通过对Lactobacillus plantarum WU14的L-阿拉伯糖异构酶基因进行生物信息学研究及其粗酶酶学性质的研究来深入了解植物乳杆菌的L-阿拉伯糖异构酶蛋白结构及其特异性。结果显示:Lactobacillus plantarum WU14 L-阿拉伯糖异构酶的构成是以α-螺旋和无规则卷曲为主且不具有信号肽也不具有跨膜结构的一类胞内酶。该酶在最佳温度60℃,最佳pH7.17,最适底物浓度为0.8mol/L反应28h时,其转化率达到56.12%。L.plantarum WU14的L-AI基因获得Genbank序列登入号:KJ778785。以不改变L-AI的氨基酸一级结构为前提,通过设计L.plantarum WU14的L-AI基因的特异性内外引物,运用重组PCR技术去除L-AI基因中的NcoⅠ酶切位点,再将重组L-AI基因插入含有NcoⅠ和HindⅢ酶切位点的食品级表达载体pRNA48中得到重组质粒并电转入Lactococcus lactis NZ9000感受态细胞中,获得了L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI。利用nisin对L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI进行诱导,提取胞内蛋白后后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和改良的半胱氨酸咔唑法分析目的蛋白的表达情况及粗酶酶活。结果显示:当菌液中nisin诱导浓度达到30ng/m L,诱导12h后,目的蛋白表达量达到最大,60℃下,粗酶酶活达到6.21U/mL。与此同时,以重悬的菌液和超声波破碎得到的粗酶液进行酶学性质研究。结果发现,在温度为50℃,pH7.17左右,D-半乳糖浓度为0.6 mol/L时,L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI转化D-半乳糖为D-塔格糖的能力最佳,转化率达到38.31%。
【学位单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q936
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
    1.1 植物乳杆菌的生理功能及其应用
    1.2 D-塔格糖研究进展
        1.2.1 D塔格糖的理化性质与作用
        1.2.2 D-塔格糖的代谢
        1.2.3 D-塔格糖的制取方法
        1.2.4 L-AI酶法制备D-塔格糖
    1.3 乳酸乳球菌食品级诱导表达载体pRNA48
    1.4 重组PCR技术
        1.4.1 重组PCR三大分支
        1.4.2 重组PCR的应用
        1.4.3 重组PCR技术要点
    1.5 课题来源、研究目的与意义
        1.5.1 本论文课题来源
        1.5.2 研究目的与意义
第二章 高产D-塔格糖乳酸菌的筛选与鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌种
        2.1.2 仪器设备
        2.1.3 主要生化试剂
        2.1.4 所用引物
        2.1.5 培养基及主要试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌株的富集培养与分离
        2.2.2 高产D-塔格糖菌株的初筛
        2.2.3 高产D-塔格糖菌株的复筛与L-AI粗酶酶活测定
        2.2.4 菌株初步鉴定
        2.2.5 改良CTAB法提取待测菌株全基因组
        2.2.6 16S rDNA的扩增
        2.2.7 16S rDNA测序及构建进化树
    2.3 结果与分析
        2.3.1 高产D-塔格糖乳酸菌的初筛结果
        2.3.2 高产D-塔格糖乳酸菌的复筛
        2.3.3 高产D-塔格糖乳酸菌菌种鉴定
    2.4 本章小结
第三章 L-AI基因的扩增、克隆及生物信息学分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌种
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 主要生化试剂
        3.1.4 所用引物
        3.1.5 培养基及主要试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 菌种活化
        3.2.2 E. coli DH5α 感受态细胞的制备
        3.2.3 L-AI基因的扩增
        3.2.4 PCR产物的纯化
        3.2.5 L-AI基因的TA克隆与菌落PCR鉴定阳性菌
        3.2.6 质粒PCR鉴定阳性菌
        3.2.7 L.plantarum WU14 L-AI基因的生物信息学研究
    3.3 结果与分析
        3.3.1 L-AI基因的扩增与比对
        3.3.2 L-AI基因的TA克隆
        3.3.3 高产D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的核苷酸序列分析
        3.3.4 高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的二级结构预测分析
        3.3.5 高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白跨膜螺旋分析和信号肽分析
        3.3.6 高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的疏水性分析
        3.3.7 高产D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的三级结构预测分析
    3.4 本章小结
第四章 L. plantarum WU14的L-AI酶学性质的研究
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验菌株
        4.1.2 实验仪器
        4.1.3 培养基及主要试剂的配制
    4.2 试验方法
        4.2.1 菌种活化、发酵培养和酶反应液的制备
        4.2.2 L. plantarum WU14的L-AI最佳转化温度的测定
        4.2.3 L. plantarum WU14的L-AI最佳转化pH的测定
        4.2.4 L. plantarum WU14的L-AI最佳底物浓度的测定
        4.2.5 各种金属离子对L. plantarum WU14的L-AI转化反应的影响
    4.3 结果与分析
        4.3.1 L. plantarum WU14的L-AI最佳转化温度
        4.3.2 L. plantarum WU14的L-AI最佳转化pH
        4.3.3 L. plantarum WU14的L-AI最佳底物浓度
        4.3.4 各种金属离子对L. plantarum WU14的L-AI转化反应的影响
    4.4 本章小结
第五章 L. plantarum WU14的L-AI在L . lactis NZ9000中的食品级诱导表达
    5.1 实验材料
        5.1.1 试验菌株及质粒
        5.1.2 实验仪器
        5.1.3 主要生化试剂
        5.1.4 所用引物
        5.1.5 培养基及主要试剂的配制
    5.2 实验方法
        5.2.1 重组PCR技术去除L-AI基因中NCOⅠ酶切位点
        5.2.2 重组质粒pRNA48-L-AI的构建
        5.2.3 连接产物电转化和克隆子筛选
        5.2.4 目的基因L-AI的诱导表达及SDS-PAGE鉴定
    5.3 结果与分析
        5.3.1 L..plantarum WU14L-AI基因NCOⅠ及HindⅢ酶切位点的判定
        5.3.2 重组PCR技术去除L..plantarum WU14的L-AI基因中的NCOⅠ酶切位点
        5.3.3 重组质粒pRNA48-L-AI的构建及验证
        5.3.4 SDS-PAGE鉴定目的基因的诱导表达
    5.4 本章小结
第六章 重组菌L. lactis NZ9000/pRNA48-L-AI的L-AI遗传稳定性分析及酶学性质研究
    6.1 实验材料
        6.1.1 试验菌株
        6.1.2 实验仪器
        6.1.3 培养基及主要试剂的配制
    6.2 试验方法
        6.2.1 nisin诱导异源L-AI基因表达的最佳诱导剂量及诱导时间
        6.2.2 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重组菌的遗传稳定性分析
        6.2.3 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重组菌L-阿拉伯糖异构酶酶学性质的研究
    6.3 结果与分析
        6.3.1 nisin诱导L-AI基因表达的最佳诱导剂量及诱导时间
        6.3.2 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重组菌的遗传稳定性分析
        6.3.3 L. lactis NZ9000/ pRNA48-L-AI重组菌L-阿拉伯糖异构酶学性质的研究
    6.4 本章小结
第七章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历

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本文编号：2890480