鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂CL-AI的制备、生物学特性及立体结构解析
发布时间：2021-04-08 07:53
鹰嘴豆种子中含有蛋白类α-淀粉酶抑制剂,这种抑制剂属于糖苷酶抑制剂的一种,它能有效地抑制肠道内产生的淀粉酶的活性,阻碍食物中碳水化合物的水解和消化,减少糖分的摄取,降低血糖和血脂的含量,减少脂肪合成,从而减轻体重;而对哺乳动物、昆虫以及微生物来源的α-淀粉酶也有很强的特异性抑制作用。α-淀粉酶抑制剂具有很重要的药用价值,是一种用于防治各种糖尿病、高血糖、高血脂及肥胖症等疾病的新型药物。同时α-淀粉酶抑制剂在农业上可作为抗虫基因或将其直接制成生物农药,对病虫害防治、减少化学杀虫剂使用,减少环境破坏和维持生态平衡等方面有重要的应用价值。本实验室前期研究中发现鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂抑制活力在不同品种间存在显著的基因型差异,并从籽粒中克隆出贮藏球蛋白型α-淀粉酶抑制候选基因CL-AI,其ORF全长1494 bp,编码497个氨基酸。在之前的研究基础上,本实验开展以下几方面的研究:①鹰嘴豆α-淀粉酶抑制剂CL-AI基因及其CL-AI-α、CL-AI-ββ亚基编码蛋白的原核表达和纯化;②CL-AI基因重组蛋白生物学特性研究;③CL-AI蛋白的初步晶体生长及筛选。主要研究结果如下:1.将CL-AI基...
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－４?ＢＡＳＩ－ＡＭＹ２复合物的三维结构图谱??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＢＡＳ１－ＡＭＹ２?ｃｏｍｐｌｅｘ．??
为化学发光检测底物工作液（一张８ｃｍ２ＰＶＤＦ膜用ｌｍＬ工作液）；??（１３）弃去ＴＢＳＴ缓冲液，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖张膜，用吸水纸吸去多余的发光底物工作液；??（１４）将膜置于化学发光成像仪中曝光成像；??２实验结果??２．１?ＣＵ／基因及其亚基Ｃ／－Ｊ／■，的亚克隆??如图２－１－Ａ为鹰嘴豆ａ－淀粉酶抑制剂Ｃ／－Ｊ／基因ＯＲＦ的结构，其ＯＲＦ全包括ｌ－６３ｂｐ的信号肽序列、６４－９３３ｂｐ的ａ链亚基序列，９３４－１４９１ｂｐ的（３链亚序列。分别采用表２－３的引物进行ＰＣＲ扩增，扩增产物由１．５％的琼脂糖电泳测，结果如图１所示：分别得到ＣＵ／、Ｃ／－Ｊ／－ａ、Ｃ／ｄ／＾两端带酶切位点（ＢａｍＩ和Ｘｈｏｌ）的完整序列，大小分别为１４２８?ｂｐ、８７０?ｂｐ、５５８?ｂｐ，特异性强、无带、与已知序列大小相符，通过测序确定这些扩增片段为目的片段。??
达载体ＰＥ－ＳＵＭ０３连接，并将连接产物进行ＰＣＲ鉴定。重组质粒（：丨－八１－??ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－｜３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?出现单一条带，与预期片??段大小相符（图２－２）。将检测正确的菌液进行测序，测序结果表明原核表达载??体构建成功。??ＢａｍＨＩ?Ｘｈｏｌ??ｃｌ－ａｉ??ＣＬ－Ａｌ－ａ??ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??伽哞，?ＣＬ－Ａｌ－Ｐ??Ｉ????Ｍ?１?２?３??ｉ?ｂｐ??ｋｉ?ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??＿?ｆｔ７４）６ｐ??１２０３ｂｐ??８９１ｂｐ??２５〇ｌ??１０〇ｌ??图２－２重组质粒的ＰＣＲ检测??Ｍ：ＤＮＡ?相对分子质；Ｗ；标准?ＤＬ２０００；?１、２?和?３：?ＣＮＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－Ｐ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、??Ｃ１－Ａ卜ｐＥ－ＳＵＭ０３?产物??Ｆｉｇ．２－２?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｂｙ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ｍａｒｋｅｒ；?１，２?ａｎｄ?３：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３，?ＣＩ－ＡＩ－ｐ－ｐＥ－ＳＵＩＶ１０３，??ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３??２．３原核表达产物的检测??将重组质粒?ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－（３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?分??别转入大肠杆菌表达菌株Ｒ〇ｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中，分别取其全菌、上清进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]温度对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响[J]. 周洪波,林福来,郑甲,郭宁,吴俊子,吴丽双,邱冠周. 当代化工. 2013(04)
[2]鹰嘴豆不同品种种子α-淀粉酶抑制剂抑制活性[J]. 郝小燕,崔竹梅,鲁海菊,顾爱星,麻浩. 西北农业学报. 2013(03)
[3]亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用[J]. 陈爱春,彭伟,汪生鹏. 中国生物工程杂志. 2012(12)
[4]重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 范翠英,冯利兴,樊金玲,果德安,刘璇. 生物技术. 2012(02)
[5]蛋白质分离纯化方法研究进展[J]. 吴少辉,刘光明. 中国药业. 2012(01)
[6]蛋白质分离纯化方法的研究进展[J]. 王红颖,王倩,黄瑾. 现代生物医学进展. 2011(S2)
[7]外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达[J]. 高炳淼,李宝珠,于津鹏,胡远艳,长孙东亭,罗素兰. 中国生物工程杂志. 2011(11)
[8]α-淀粉酶蛋白类抑制剂的研究进展[J]. 魏鹏娟,王鲁峰,徐晓云,潘思轶. 食品科学. 2011(09)
[9]鹰嘴豆的应用价值及其研究与利用[J]. 张金波,苗昊翠,王威,热依拉,李利民. 作物杂志. 2011(01)
[10]糖尿病治疗药物的研究进展[J]. 李雅玲,李珊,李富华. 临床合理用药杂志. 2010(11)
本文编号：3125167
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：101 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－４?ＢＡＳＩ－ＡＭＹ２复合物的三维结构图谱??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＢＡＳ１－ＡＭＹ２?ｃｏｍｐｌｅｘ．??
为化学发光检测底物工作液（一张８ｃｍ２ＰＶＤＦ膜用ｌｍＬ工作液）；??（１３）弃去ＴＢＳＴ缓冲液，将发光底物工作液滴加在印迹膜上，确保工作液覆盖张膜，用吸水纸吸去多余的发光底物工作液；??（１４）将膜置于化学发光成像仪中曝光成像；??２实验结果??２．１?ＣＵ／基因及其亚基Ｃ／－Ｊ／■，的亚克隆??如图２－１－Ａ为鹰嘴豆ａ－淀粉酶抑制剂Ｃ／－Ｊ／基因ＯＲＦ的结构，其ＯＲＦ全包括ｌ－６３ｂｐ的信号肽序列、６４－９３３ｂｐ的ａ链亚基序列，９３４－１４９１ｂｐ的（３链亚序列。分别采用表２－３的引物进行ＰＣＲ扩增，扩增产物由１．５％的琼脂糖电泳测，结果如图１所示：分别得到ＣＵ／、Ｃ／－Ｊ／－ａ、Ｃ／ｄ／＾两端带酶切位点（ＢａｍＩ和Ｘｈｏｌ）的完整序列，大小分别为１４２８?ｂｐ、８７０?ｂｐ、５５８?ｂｐ，特异性强、无带、与已知序列大小相符，通过测序确定这些扩增片段为目的片段。??
达载体ＰＥ－ＳＵＭ０３连接，并将连接产物进行ＰＣＲ鉴定。重组质粒（：丨－八１－??ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－｜３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?出现单一条带，与预期片??段大小相符（图２－２）。将检测正确的菌液进行测序，测序结果表明原核表达载??体构建成功。??ＢａｍＨＩ?Ｘｈｏｌ??ｃｌ－ａｉ??ＣＬ－Ａｌ－ａ??ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??伽哞，?ＣＬ－Ａｌ－Ｐ??Ｉ????Ｍ?１?２?３??ｉ?ｂｐ??ｋｉ?ｐＳＵＭ０３?Ａｍｐ??＿?ｆｔ７４）６ｐ??１２０３ｂｐ??８９１ｂｐ??２５〇ｌ??１０〇ｌ??图２－２重组质粒的ＰＣＲ检测??Ｍ：ＤＮＡ?相对分子质；Ｗ；标准?ＤＬ２０００；?１、２?和?３：?ＣＮＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－Ｐ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、??Ｃ１－Ａ卜ｐＥ－ＳＵＭ０３?产物??Ｆｉｇ．２－２?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｌａｓｍｉｄｓ?ｂｙ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｍ：?ＤＬ２０００?ｍａｒｋｅｒ；?１，２?ａｎｄ?３：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３，?ＣＩ－ＡＩ－ｐ－ｐＥ－ＳＵＩＶ１０３，??ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３??２．３原核表达产物的检测??将重组质粒?ＣＩ－ＡＩ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－ａ－ｐＥ－ＳＵＭ０３、ＣＩ－ＡＩ－（３－ｐＥ－ＳＵＭ０３?分??别转入大肠杆菌表达菌株Ｒ〇ｓｅｔｔａ（ＤＥ３）中，分别取其全菌、上清进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]温度对β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中表达的影响[J]. 周洪波,林福来,郑甲,郭宁,吴俊子,吴丽双,邱冠周. 当代化工. 2013(04)
[2]鹰嘴豆不同品种种子α-淀粉酶抑制剂抑制活性[J]. 郝小燕,崔竹梅,鲁海菊,顾爱星,麻浩. 西北农业学报. 2013(03)
[3]亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用[J]. 陈爱春,彭伟,汪生鹏. 中国生物工程杂志. 2012(12)
[4]重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 范翠英,冯利兴,樊金玲,果德安,刘璇. 生物技术. 2012(02)
[5]蛋白质分离纯化方法研究进展[J]. 吴少辉,刘光明. 中国药业. 2012(01)
[6]蛋白质分离纯化方法的研究进展[J]. 王红颖,王倩,黄瑾. 现代生物医学进展. 2011(S2)
[7]外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达[J]. 高炳淼,李宝珠,于津鹏,胡远艳,长孙东亭,罗素兰. 中国生物工程杂志. 2011(11)
[8]α-淀粉酶蛋白类抑制剂的研究进展[J]. 魏鹏娟,王鲁峰,徐晓云,潘思轶. 食品科学. 2011(09)
[9]鹰嘴豆的应用价值及其研究与利用[J]. 张金波,苗昊翠,王威,热依拉,李利民. 作物杂志. 2011(01)
[10]糖尿病治疗药物的研究进展[J]. 李雅玲,李珊,李富华. 临床合理用药杂志. 2010(11)
本文编号：3125167
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