微生物修复石油污染土壤的生态毒性指示

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生态环境学报 2015, 24(9): 1560-1569 Ecology and Environmental Sciences E-mail: editor@jeesci.com

微生物修复石油污染土壤的生态毒性指示

沈伟航，朱能武

1

1, 2*

，尹富华，王华金，党志

111, 2

1. 华南理工大学环境与能源学院，广东 广州 510006；2. 工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室，广东 广州 510006

摘要：发光菌的相对发光度和植物光合色素含量以及土壤酶活性是土壤石油污染程度和生态毒性强弱的综合反映。为探究不同生物指示方法对石油污染土壤生态毒性的指示效果以及污染土壤在生物修复过程中毒性的变化规律，采用前期筛选分离的三株对石油烃具有良好降解效果的降解菌构建混合菌体系，开展石油污染土壤模拟微生物修复实验。文章首先以明亮发光杆菌为指示生物考察不同修复时期土壤生态毒性，并以高等植物毒性试验以及土壤酶活性试验结果作为辅助证据从生态学角度揭示修复过程中石油污染土壤生态毒性的变化，并分析了以上3种指示方法的一致性。结果表明，该混合菌能高效降解对石油烃污染物，污染土壤经40 d修复后，石油烃污染物浓度从5000 mg·kg-1 降到1781 mg·kg-1，去除率达到64%。高等植物生态毒性试验、土壤酶活性试验与发光菌生态毒性试验结果呈现良好的一致性，石油污染土壤的生态毒性随着微生物修复过程的进行呈先上升后下降的趋势。具体而言，修复初期的土样对小麦光合色素含量的抑制作用最大，叶绿素a含量相对于对照组降低了39.3%，仅为(1.36±0.04) mg·g-1；土壤过氧化氢酶酶活性与石油烃残留量呈极显著负相关关系（-0.973）；污染土壤生态毒性在修复的第8天达到最大，其二氯甲烷/二甲基亚砜浸提液中发光菌的相对发光度为18.1%，与0.187 mg·L-1 HgCl2的毒性相当。明亮发光杆菌的相对发光度和小麦光合色素含量以及土壤过氧化氢酶活性能较好地指示石油污染土壤在生物修复过程中的生态毒性，可作为石油污染土壤微生物修复效果的指示生物。 关键词：石油污染土壤；生物修复；发光菌；生物指示 DOI: 10.16258/j.cnki.1674-5906.2015.09.021

中图分类号：X171.5；X172 文献标志码：A 文章编号：1674-5906（2015）09-1560-10

引用格式：沈伟航，朱能武，尹富华，王华金，党志. 微生物修复石油污染土壤的生态毒性指示[J]. 生态环境学报, 2015, 24(9): 1560-1569.

SHEN Weihang, ZHU Nengwu, YIN Fuhua, WANG Huajin, DANG Zhi. Study on Combined Bioindicators in Ecotoxicity Monitoring of Oil-contaminated Soil during Bioremediation [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2015, 24(9): 1560-1569.

石油工业的迅猛发展使得石油污染物对土壤的污染状况日趋严重。石油污染物（烷烃类、芳香烃类以及苯类等）毒性大且具有致癌作用，进入土壤后难以去除，并会引发土壤性质变化甚至地下水污染等重大生态危机，如何有效地修复石油污染土壤已成为全球性的环境难题（黄廷林等，2009）。在众多修复方法中，石油污染土壤的微生物修复以其对土壤环境干扰小、成本低廉、无二次污染等优点，正逐步成为国内外学者的一个研究热点（王华金等，2013）。然而，要成功运作石油污染土壤微生物修复仍面临诸多难题。研究表明，恢复污染土壤的原有生态功能是一个缓慢且复杂的过程（宋玉芳等，2004）。随着微生物修复过程的进行，污染土壤逐步向健康状态转变，并伴随着土壤及微生物一系列生理生化指标的变化。对石油污染土壤的微生物修复过程及此过程中土壤健康状况的监测、指示以及生态毒理学研究有助于全面掌握石油污染土壤微生物修复过程中生态毒性的强弱及变化规律。

已有研究表明，土壤生态系统中的敏感指示物能够较为全面地反映土壤生态毒性（刘五星等，2007）。针对石油污染土壤生态毒性的指示和评价系统，国内外学者提出了包括发光菌毒性试验、高等植物毒性试验和土壤酶活性试验在内的多种生态毒性试验方法。在这些生态毒性指示方法中，发光细菌生态毒性试验以其相关性好，灵敏性高、监测效率高等优点而被国内外学者广泛应用于石油污染土壤修复过程中土壤生态毒性的评价与监测（林志芬等，2001）。有学者采用发光细菌生态毒性性试验来评价生物堆肥16个月之后的石油污染土壤的生态毒性，土壤毒性的最大值出现在堆肥的初期，随着堆肥过程的进行，土壤生态毒性呈减弱趋势，但仍有较高的生态毒性（Chaineau et al.，

基金项目：广东省自然科学基金团队项目（9351064101000001）；教育部新世纪优秀人才支持计划项目（NCET-11-0166） 作者简介：沈伟航（1988年生），男，硕士，主要研究方向为生态毒理与生物指示。Email: shen.wh@mail.scut.edu.cn

*通讯作者。朱能武，E-mail: nwzhu@scut.edu.cn

收稿日期：2015-07-08

沈伟航等：微生物修复石油污染土壤的生态毒性指示 1561

2003）。有研究通过发光细菌生态毒性试验研究两种不同堆肥条件下的石油污染土壤发现，自然条件下堆肥处理的生态毒性最高可达到人工强化堆肥的4倍（P?aza et al.，2005）。高等植物作为土壤生态系统中的基本组成部分，利用其生长发育状况及叶片生理生化指标来指示土壤生态毒性是土壤污染生态毒理学诊断的重要组成部分。Banks et al.（2005）以莴苣、粟、萝卜、红三叶草和小麦的种子发芽率为指标，考察它们作为供试植物的可行性，结果表明，仅莴苣种子能准确地指示受污土壤和净土之间生态毒性的差异。土壤酶活性作为土壤微生物新陈代谢是否正常的关键性指标，是土壤整体健康状况的综合反映（张晓阳，2013），将土壤酶活性作为土壤生态毒性的指示物，也具有理论上的可行性。研究表明，在柴油污染土壤的生物修复过程中土壤脂肪酶和脱氢酶与石油烃残留量呈显著负相关，而β葡萄糖苷活性与土壤中石油烃残留量呈显著正相关（Riffaldi et al.，2006）。

虽然上述方法在生态毒性指示方面各有优势，但是涉及不同指示方法的指示效果研究以及它们之间的一致性分析还比较少。由于通过不同指示生物对土壤生态毒性进行指示和评价能够有效地整合土壤中不同食物链生物对有毒有害物质的整体毒性效应，可以较为全面地反映土壤的受污情况。因此，石油污染土壤微生物修复过程需要整合各种生态毒性指示和评价方法对土壤生态系统的安全性做出全面、科学地判断。课题组前期研究表明，土壤过氧化氢酶活性与土壤中的残留石油烃相关系数最大（王华金等，2013）；小麦与萝卜相对于莴苣、黑麦草以及小青菜更适合作为供试植物来指示石油污染土壤的生态毒性变化（沈伟航等，2015）。然而前期研究并未涉及石油污染土壤的复合指示效果研究以及不同指示方法之间的一致性分析。基于此，本研究选取明亮发光杆菌，土壤过氧化氢酶活性以及小麦和萝卜的叶片光合色素毒性试验来进一步探究石油污染土壤生态毒性变化规律以及不同方法之间的一致性分析。文章首先通过发光菌毒性试验考查石油污染土壤微生物修复过程中土壤的生态毒性强弱及变化规律，通过度量发光细菌在不同修复时期土壤中的相对发光强度，并结合毒性等级划分标准确定石油污染土壤发光菌指示的可行性与敏感性。随后，文章以高等植物毒性试验及土壤酶活性试验结果作为辅助证据从生态学角度揭示石油污染土壤微生物修复过程中残留的石油污染物和中间代谢产物对土壤生态系统的影响，在佐证发光菌毒性试验结果的同时也完成了石油污染土壤微生物修复过程中污染土壤的生

态毒性变化规律的探究及指示效果的一致性分析。

1 材料与方法

1.1 混合菌的制备

本研究选取课题组前期分离出的洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderiacepacia）中的烷烃降解菌GS3C（CCTCC No. M 207169）；鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）中的菲降解菌GY2B（CCTCC No. M 206019）；伯克菌科Pandoraea菌属的pnomenusa种中的芘降解菌GP3B（CCTCC No. M207167）为初始菌种资源。将上述3种菌株分别取1环进行富集培养，然后在25 mg·mL-1的原油无机盐培养基（5.0 mL PBS， 1.0 mL CaCl2溶液，1.0 mL FeCl3溶液，3.0 mL MgSO4 溶液，1.0 mL微量元素，1000 mL蒸馏水）中分别加入1 mL富集液，接着将投加了石油降解菌的原油无机盐培养基置

，每5于的摇床中驯化培养（30 ℃，150 r·min-1）

天为一个驯化周期，共驯化55 d后离心分离分别获取3种驯化产物。最后将驯化后的GS3C、GY2B、GP3B菌（4.0×108 CFU·mL-1）按等量配比的原则（1∶1∶1，V/V/V）复配后形成石油烃降解混合菌。 1.2 石油污染土壤的制备

供试土壤采自广东增城的水稻田表层土壤。土壤取回经干燥处理后过4.75 mm筛，去除大颗粒物质后分为两份，一份保存在4 ℃冰箱中并于避光条件下测定新鲜土样的初始指标（表1），另一份置于阴凉处风干后过2 mm筛，保存待用。实验用油由广州石化提供的原油（饱和烃：45.55%，，芳烃：17.69%，胶质和沥青质：9.68%）。

表1 供试土壤的理化性质

Table 1 Basic physiochemical properties of the tested soils 处理

1

对照土样 污染土壤(S1)

pH 6.42±0.17 5.82±0.25

-1

TOC/(g·kg) 16.20±0.57 18.95±0.50* TN2/(g·kg-1) 0.86±0.11 0.82±0.04 TP3/(g·kg-1) 0.52±0.04 0.53±0.03 TK4/(g·kg-1) 4.48±0.38 4.34±0.30 *表示与清洁土壤对照土样间具有差异显著性，P<0.05（n=3） TOC1：Total Organic Carbon，总有机碳；TN2：Total Nitrogen，总氮；TP3：Total Phosphorus，总磷；TK4：Total kalium，总钾

在φ15 cm×20 cm塑料盆装入3 kg干土，将溶于石油醚中的石油均匀地加入土壤中，使土壤中石油烃的初始浓度为5000 mg·kg-1（每千克干土中含5 g原油），并搅拌均匀（Vouillamoz et al.，2001）。接着按3%（每100 g土加3 mL石油烃降解混合菌菌液）的比例接种到石油污染土壤中。

最后将各培养皿置于恒温培养箱（30 ℃）中进行石油污染土壤的微生物修复实验，每2天翻土搅拌一次并维持土壤含水率的稳定。实验过程中，

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采集微生物修复第0、8、16、24、32、40 d的土壤，分别标记为S1，S2，S3，S4，S5，S6，同时采集净土标记为S0，将这7个土样作为不同微生物修复时期的石油污染土壤，备用（Tang et al.，2010）。 1.3 测试项目及方法

1.3.1 供试原油的标准曲线

原油标准溶液的配制：准确称取0.1000 g原油，加入少量正己烷，将其溶解后转移至50 mL容量瓶中定容，然后摇匀，配制成2 mg·mL-1的标准溶液。系列浓度原油标准溶液的配制：分别移取上述原油标准溶液1、3、5、7、9 mL于25 mL容量瓶中，并用正己烷定容。再分别取1 mL的系列原油溶液定容于25 mL容量瓶中，配成标准系列的浓度分别是3.2、9.6、16、22.4、28.8 mg·L-1。在绘制标准曲线前，先取少量原油标准液于紫外-分光光度计的220~260 nm处进行光谱扫描，找出本研究中油样的最大吸收波长。然后在最大吸收波长下分别测定标准浓度油样的吸光度，并将数据进行线性回归分析，绘制标准曲线。

石油及其产品在紫外区有特征吸收，带有苯环的芳香族化合物的主要吸收波长为250~260 nm，带有共轭双键的化合物主要吸收波长为215~230 nm，一般原油的两个主要吸收波长为225及254 nm（何丽媛，2010）。本研究中的原油样品在220~260 nm的特征吸收波段下的扫描结果如图1（a）所示。可以看出，原油样品在波长225 nm和235 nm处均出现了较强的吸收峰，其中在波长225 nm处为最大吸收峰。研究认为，在最大吸收峰处吸收最大、干扰最小（李宝明，2007）。故本研究中选取225 nm作为最佳吸收波长。在最大吸收峰波长225 nm下，分别测定标准油样品溶液的吸光度。为了能够更准确的反映样品浓度和吸光度之间的关系，对实验数据进行回归分析，得到标准曲线，如图1（b）所示。

标准曲线的线性回归方程为：

y=32.166 x+0.0037（r2=0.9994） （1） 式中：y—吸光值；x—原油浓度，mg·mL-1。 1.3.2 土样中总石油烃含量的测定

称取风干土壤5 g于50 mL离心管中，加入适量Na2SO4和10 mL正己烷，然后在1800 r·min-1条件下振荡1 min，再将其超声半小时并离心（3000

-1

r·min，10 min）收集上清液。重复上述操作4次，确保土样中的石油烃全部被提取出来。将上述上清液过0.45 μm的有机系滤膜后移至旋转蒸发仪（RE-52CS）中进行浓缩，用25 mL的容量瓶定容，最后在225 nm波长处测定其吸光度值，对照石油的标准曲线，计算出石油污染土样中石油烃残留量和降解率（Han et al.，2009）。

??=

??????????????

×100% （2）

式中：????为土样中石油烃的初始含量；????为不同微生物修复时期土样中石油烃的残留量。 1.3.3 发光细菌的生态毒性测定

将等质量的污染土壤与无菌蒸馏水混合，在25 ℃条件下，在振荡机（HZQ-F160）上反复振荡（120 r·min-1）1 h，随后土壤水样于4000 r·min-1的条件下离心30 min，过滤备用。污染土壤二氯甲烷（DCM）/二甲基亚砜（DMSO）浸提液制备：称取5.0 g土壤，用二氯甲烷（DCM）超声提取30 min，然后在4000 r·min-1的条件下离心10 min，收集上层液体。重复上述操作4次，确保土壤中的石油烃全部被洗出。然后将萃取液减压旋转浓缩至5 mL，再加入5 mL二甲基亚砜（DMSO），然后将该混合物继续浓缩至5 mL，备用（刘五星等，2007）。

发光菌生态毒性测试在2 mL的测试管中进行，分别向测试管中加入200 μL 22%的NaCl溶液，200 μL的待测溶液，1580 μL的去离子水，20 μL的复苏好的菌液。加完复苏好的菌液（实验所采用的明亮发光杆菌，T3变种冻干粉购于中国科学院南京土

吸光度

λ/nm

吸光度

ρ/(mg·L-1)

（a）吸光度-波长曲线；（b）标准曲线

图1 原油标准曲线的绘制

Fig. 1 The drafting of crude oil standard curves

沈伟航等：微生物修复石油污染土壤的生态毒性指示 1563

壤研究所）后盖上瓶塞，用手颠倒5次，拔取瓶塞，放回测试架上（Bundy et al.，2004）。反应15 min后在生态毒性测试仪上测定其发光强度（mV）。本研究采用相对发光度（%）（样品的发光强度除以对照的发光强度），同时根据参比毒物氯化汞的标准曲线，计算出与样品急性毒性相当的氯化汞浓度

。 （mg·L-1）

1.3.4 光合色素含量的测定

取不同微生物修复时期的石油污染土样各100 g于不同培养皿中，再将小麦（Triticum aestivnm L.）和萝卜（Raphanus sativus L.）种子（各20粒，购于广东省农业科学院），均匀嵌入不同培养皿的土样中，再在种子上面均匀覆盖20 g对应修复时期的供试土壤，并调节土壤含水率（Al-Mutairi et al.，2008），随后盖好玻璃培养皿并置于25 ℃光照培养箱（SPX-250）中培养。黑暗培养2 d后进行为期3 d的光照和黑暗交替培养，每天光照16 h，黑暗培养8 h，维持光照强度为4300 lux（Al-Mutairi，2008；Banks et al.，2005）。种子发芽后在之前的光照条件下继续培养9 d后，测定不同土壤中小麦和萝卜的叶片叶绿素a和类胡萝卜素含量。具体操作为：准确称取新鲜植物叶片0.1 g（鲜重）用10 mL100%甲醇进行提取，然后放入4 ℃冰箱中，静止提取24 h后，提取液在4 ℃、2000 r·min-1下离心15 min，保留上清液。用甲醇做参比溶液，在紫外可见分光光度计下扫描上清液，得到其在400~750 nm波段的吸光度值。

叶绿素a的含量根据Porra的计算公式（3）计算（Porra，2002），类胡萝卜素的含量，根据公式（4）计算（Parsons et al.，1963）：

Chl-a(μg·mL-1)=16.29×(A665-A750)-8.54×(A652-A750)

（3）

Car(μg·mL-1)=7.6×[(A480-A750)-1.49×(A510-A750)] （4）

式中：A750、A665、A652、A510、A480分别代表波长为750、665、652、510和480 nm下的吸光度值。 1.3.5 过氧化氢酶活性

过氧化氢酶的测定采用高锰酸钾滴定法测定（周礼恺等，1980）：取5 g过1 mm筛的风干土样、置于150 mL锥形瓶中，注入40 mL蒸馏水和5 mL 0.3%过氧化氢。另设对照（往瓶中注入40 mL蒸馏水和5 mL 0.3%过氧化氢，而不加土样）。将瓶塞紧，

振荡30 min。随后，置于120 r·min-1往返式摇床上，

-1

注入5 mL1.5 mol·L硫酸以终止反应，将瓶中内容物用致密滤纸过滤。取25 mL滤液用0.1 mol·L-1高锰酸钾溶液滴定至微红色。土壤的过氧化氢酶活性，以单位重量土壤消耗的0.1 mol·L-1高锰酸钾毫升数（对照与试验测定的差值）表示，也可以将高锰酸钾毫升数转化为氧化氢的毫克数表示。

注：实验所用试剂均为分析纯，购于阿拉丁。 1.4 数据处理

实验数据使用SPSS 17.0软件进行差异显著性（P=0.05和P=0.01）和相关性统计分析。结果以算术平均值±标准差的形式表示。

2 结果与讨论

2.1 石油污染土壤的微生物修复作用

不同微生物修复时期土壤中总石油烃降解率及残留量如图2a和2b所示。整体来看，与不投加混合菌的石油污染土壤相比，投加混合菌的污染土壤在石油污染土壤微生物修复的各阶段都表现出更高的石油烃降解率以及更低的残留量。具体而言，在投加菌剂的污染土壤中，从土样S1到S2石油烃降解率有一个急速的增长过程，之后随微生物修复过程的进行而稳步上升，在土样S2~S6中石油烃表观降解率在54%~64%范围内变化，从土样S5开始石油烃的降解率基本维持在64%左右（图2a），

（图相应地，残留量也基本保持稳定（1.79 mg·g-1）

2b）。在微生物修复的前期，石油污染物的进入为

总石油烃降解率/%

石油烃残留量/(mg·g-1)

n=3

图2 不同修复时期的土壤中石油烃残留量及表观降解率

Fig. 2 Changes in TPH removal efficiency and residual oil during different phases of bioremediation

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