细胞增殖的蛋白质组学研究

发布时间：2018-01-25 06:27

  本文关键词： 质谱 RNA编辑酶 蛋白质组学 增殖细胞核抗原 蛋白翻译 细胞增殖 H2A/K 长非编码RNA 质谱 定量蛋白质组学 增殖细胞核抗原 细胞增殖　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景作用于RNA的腺嘌呤脱氨基酶(ADAR)是双链RNA编辑酶的一种,这种酶能特异地把双链RNA上的腺嘌呤转变为次黄嘌呤(Ⅰ),在RNA的翻译或反转录时次黄嘌呤(Ⅰ)会作为鸟嘌呤(G)翻译或反转录。ADAR同源基因存在于从单细胞的原核生物到人等的广泛生物中,可见这个基因在进化上非常保守。在哺乳动物中发现RNA的腺嘌呤脱氨基酶(ADAR)有三种类型,分别是ADAR1、ADAR2和ADAR3。ADAR3只在脑中表达。ADARl和ADAR2广泛存在于多种组织内,其中ADARl被研究较多。ADAR1有两种亚型：一种是分子量为150kd全长的能核质穿梭的p150和另一种是分子量为110kd非全长的只分布核内的p110。全长的ADAR1由N端的2个ZDNA结构域及3个双链RNA结合域和C端的1个末端有入核序列的脱氨基酶结构域组成,在全长ADAR1的N端有出核序列。在这里,ADAR1指全长的分子量为150kd-型。ADAR1是胚胎发育必需的重要蛋白,杂交鼠实验证明,ADAR1表达减少的胚胎干细胞不能发育成肝、骨髓、脾、胸腺和血液红细胞,因而,ADAR1是哺乳动物发育所必需的基因。ADAR1广泛存在于真核细胞中,同时参与多种细胞过程,比如胚胎红细胞形成、免疫反应和细胞各种应激过程。鉴于ADAR1下调抑制细胞生长的现象,我们想至ADAR1过表达会改变细胞功能,在这里我们应用定量蛋白质组学方法来研究ADAR1过表达对细胞增殖的影响。研究目的1.应用蛋白质组学方法分析ADAR1对细胞蛋白表达的影响2.证明ADAR1具有促进细胞增殖的功能研究方法1-构建表达ADAR1质粒把编码小鼠全长ADAR1氨基酸的cDNA序列克隆到pEGFP-N1载体上,构建ADAR1表达质粒。用同样方法把缺少脱氨基酶域的突变ADAR1序列克隆到pEGFP-N1载体上,构建对照质粒Mutant。2.细胞培养和转染人肾细胞HEK293T被放在改良的高糖培养基DMEM(10%FBS)中,在37℃含有5%二氧化碳的细胞培养箱中培养。DNA转染使用英潍捷基公司的Lipofectamine 2000转染试剂完成3.蛋白提取用于细胞外ADAR1活性检测和蛋白质组分析分别转染N1_ADAR1和N1_mutant质粒的HEK293T细胞培养48小时后,使用预冷的带有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取细胞蛋白,用BCA法检测蛋白浓度。4.双链RNA制备和细胞外ADAR1编辑活性测定1飞摩尔的双链RNA底物分别加入到混有50微克表达ADAR1细胞蛋白或表达Mutant细胞蛋白的0.5毫升编辑缓冲液中,混匀后在37度孵育2小时。纯化编辑后的双链RNA,反转录成cDNA链,PCR扩增被编辑的RNA底物,经PCR清洁试剂盒纯化后测序。5.蛋白溶液内胰酶酶解对于定量蛋白质组分析,200微克的细胞裂解液加入二硫苏糖醇(DTT)到20mM摩尔浓度,置于56度还原30分钟去掉二硫键,然后加入碘乙酰胺(IAA)到50mM摩尔浓度,避光置于26度20分钟,烷基化保护已经被还原的二硫键。之后加入测序级修饰过的胰酶(1：50的质量比)置于37度消化24小时,消化后的蛋白溶液用10k的超滤管以15000g离心30分钟超滤得到肽段,超滤过的肽段混合液用ZipTip C18柱子脱盐纯化,然后收集脱盐纯化后的肽段,冻干后放在-20度保存用于进一步分析。6.色谱-二级串联质谱分析肽段是采用高压液相色谱(HPLC, Thermo EASY-nLC System)分离和用电喷雾串联的混合线性离子井质谱仪(Thermo LTQ Orbitrap Velos Elite, Thermo)测定肽段的质荷比进行分析。对于每一次分析,样品先加到C18预分析柱上,然后通过C18反相分析柱,用线性的溶剂梯度把肽段从C18分析柱上洗脱下来。肽段以阳离子模式进行分析,一级质谱使用离子井分析仪以质荷比范围在300-1800之间,分辨率为60,000以图谱方式获得。二级质谱分析通过诱导碰撞解离模式(CID)完成。以相同方式完成3次重复样品的分析。7.数据分析和肽段鉴定来源于每个样品的二级质谱(CID)数据使用蛋白质组分析软件(Proteome Discoverer 1.4)以2014年10月21日SWISS-PROT中人的蛋白质数据库为基础进行蛋白搜索鉴定。8.蛋白的非标记定量所有6个样品质谱分析数据使用Progenesis LC-MS软件(4.1版本：Nonlinear Dynamics,英国)进行非标记蛋白定量分析。定量的统计学分析以ANOVA t test p0.05认为有统计学意义,当蛋白丰度改变小于1.5倍(ADAR1/mutant)时蛋白被抛弃。9.差异表达蛋白的生物信息学分析来自于Progenesis LC-MS软件分析的ADAR1和Mutant组间差异表达蛋白数据,通过著名的PANTHER(http://www.pantherdb.org/)基因聚类软件分析,得到因ADAR1过表达而调整的蛋白功能分类的分析结果；通过著名的STRING (http://www.string-db.org/)蛋白相互作用软件分析。得到因ADAR1过表达而调整的蛋白相互作用网络的分析结果。10.蛋白Western blot分析Western blot分析由分别转染ADAR1和Mutant质粒的HEK293T细胞提取的蛋白来完成,细胞在冰冷RIPA裂解液中裂解和进行蛋白提取。上样的50微克蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后电转到NC膜上,经5%牛血清蛋白封闭后孵育一抗、孵育二抗和扫膜,用ImageJ图像分析软件进行灰度值分析。11.细胞增殖检测11.1 EDU细胞增殖检测HEK293T细胞和A549细胞分别以2500细胞／孔的密度种植在24孔板的12个孔上(HEK293T细胞和A549细胞各两组,每组3个孔)。在含10%胎牛血清的DMEM培养基中37度培养12小时,然后按之前转染步骤按比例分别转染ADAR1质粒和Mutant质粒到HEK293T细胞两个组或A549细胞两个组中。36个小时之后,细胞增殖实验用EdU细胞增殖试剂盒来完成。EdU标记新增殖的细胞(红色)和Hoechst 33342标记全部细胞(蓝色)后,选取200倍的放大倍数在倒置荧光显微镜下观察。使用Image-Pro Plus 6.0 (IPP 6.0)软件计算分析EDU阳性的增殖细胞在全部细胞中的比率。11.2 MTT细胞增殖检测用MTT检测细胞增殖,在这个检测中,HEK293T细胞和A549细胞分别以每孔3000个细胞密度种植在96孔板中,两种细胞分别以两组每组重复5孔种植。在含10%胎牛血清的DMEM培养基中37度培养24小时,DNA转染用lipo-2000按之前转染步骤按比例在每种细胞的两组中分别转染ADAR1质粒和Mutant质粒。孵育48小时后,在每孔100微升的培养基中加入10微升的MTT溶液,孵育4个小时后,小心地去掉培养基,每孔加入100微升的DMSO溶解结晶,然后用酶标仪在570纳米和630纳米两个波长上测定OD值。570纳米测定的吸光度减去630纳米测定的吸光度(培养板塑料孔和细胞碎屑引起的吸光度),然后对测得的数值进行统计分析。12.统计学分析ANOVAttest用于蛋白定量统计分析,当p0.05时被认为有统计学意义。其他定量分析应用Student' sttest检验,当p0.05时被被认为有统计学意义。定量数据由平均数±标准差来表示。研究结果1. HEK293T细胞中ADAR1的表达增加双链RNA编辑活性2. 过表达ADAR1改变了HEK293T细胞中的蛋白表达HEK293T细胞表达的ADARl改变了细胞蛋白表达,在370个有差异变化的蛋白表达中,211个蛋白被上调和159个蛋白被下调。这些数据显示了转染HEK293T细胞表达的ADAR1改变了细胞蛋白表达。3. ADAR1调整的差异表达蛋白聚类分析为ADARl促进细胞增殖提供了分子水平的支持4. ADARl过表达上调了蛋白翻译和细胞周期两个相互作用网络STRING数据库分析结果显示ADAR1过表达调整了蛋白翻译和细胞周期两个网络,蛋白翻译网络包括4个核糖体小亚基蛋白(RPS5、RPS3、RPS13和RPS10),7个核糖体大亚基蛋白(RPL7、RPL10、RPL22、RPL28、RPL35、RPL36A和MRPL49),6个真核细胞翻译起始因子(EIF3A、EIF3G、EIF3I、 EIF3L、EIF4G2和EIF5B)和2个真核细胞翻译延伸因子(EEF1A1和EEF1A2)。细胞周期网络是以增殖细胞核抗原(PCNA)为中心的网络。5. ADAR1过表达上调了PCNA-细胞增殖蛋白相互作用网络在PCNA蛋白相互作用网络里,PCNA是通过与其他蛋白KA-box和/或PIP-box相互作用,这些上调的蛋白促进细胞增殖。这些通过KA-box和／或PIP-box与PCNA相互作用的ADAR1调整的细胞增殖类蛋白包括前mRNA处理因子19 (PRPF19),X射线互补缺陷修复蛋白(XRCC5)。6. Western blotting分析确认了过表达ADAR1上调一些与细胞增殖相关的蛋白。western blotting分析结果与非标记定量蛋白质组分析结果一样,转染ADAR1的HEK293T细胞中,代表细胞增殖标志的PCNA蛋白表达上调2.0倍(p0.01,n=3),前mRNA处理因子19 (PRPF19)上调1.76倍(p0.01,n=3)和X射线互补缺陷修复蛋白(XRCC5)上调1.6倍(p0.01,n=3)。核输出蛋白Exportin-5调节与蛋白翻译有关的成分(包括延伸因子a1, tRNA和信号识别颗粒RNA)。Western blotting分析结果显示ADAR1过表达上调Exportin-5到1.56倍(p0.01,n=3)。7.细胞增殖功能检验结果显示过表达ADAR1的HEK293T细胞和A549细胞增殖比率增加应用5-乙炔基-2脱氧尿苷(EDU)和3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)两种方法检测过表达ADAR1的HEK293T细胞和A549细胞的细胞增殖率。EDU细胞增殖检测结果是：过表达ADAR1的HEK293T细胞的细胞增殖比率是0.58+0.08,转染Mutant的HEK293T细胞的细胞增殖比率是0.26+0.04；过表达ADAR1的A549细胞的细胞增殖比率是0.24+0.04,转染Mutant的A549细胞的细胞增殖比率是0.15+0.01；数值表示为平均值±标准方差。EDU细胞增殖检测结果与非标记定量蛋白质组分析一致,过表达的ADAR1上调HEK293T细胞增殖比率2.2倍(p0.01,n=3),同时过表达的ADAR1上调A549细胞增殖比率1.6倍(p0.01,n=3)。MTT细胞增殖检测结果是：过表达ADAR1的HEK293T细胞的细胞增殖指数是1.59+0.20,转染Mutant的HEK293T细胞的细胞增殖指数是0.79±0.10；过表达ADAR1的A549细胞的细胞增殖指数是0.96±0.14,转染Mutant的A549细胞的细胞增殖指数是0.59±0.14；数值表示为平均值±标准方差。MTT细胞增殖检测结果也与非标记定量蛋白质组分析一致,过表达的ADAR1上调HEK293T细胞增殖指数2.0倍(p0.001,n=3),同时过表达的ADAR1上调A549细胞增殖指数1.6倍(p0.001,n=3)。结论1.通过应用液相-串联质谱技术和非标记定量的蛋白质组分析,我们认为过表达的ADAR1上调了基因转录、蛋白翻译、蛋白运输和细胞周期过程相关基因,这些被上调的相关基因都有利于细胞增殖。2.过表达的ADAR1上调了蛋白翻译相互作用网络和细胞周期相互作用网络,同时过表达的ADAR1上调了以增殖细胞核抗原(PCNA)为核心的细胞增殖相互作用网络,过表达的ADAR1上调的这三个蛋白相互作用网络共同促进了细胞增殖。从而在蛋白分子水平上证明了ADAR1过表达促进细胞增殖。3.两种方法的细胞增殖功能实验都证明了过表达的ADAR1能促进HEK293T细胞和A549细胞的细胞增殖比率,在细胞水平上也确定了ADAR1促进细胞增殖的结果。过表达的ADAR1促进细胞增殖的功能在蛋白质组分子水平上和细胞水平上都得到了证明研究背景一些假基因通过形成长非编码RNA作用于相应的转录子而被认为有活性。HIST1H2APS4也称为H2A/K,是一个假基因,然而很少有人关注这个假基因,更很少有人对这个假基因突变进一步研究。我们实验室的数据分析结果显示,10个肾癌病人中7个携带突变的H2A/K假基因：其中4个肾癌病人携带的突变H2A/K假基因是C228A突变；2个肾癌病人携带的突变H2A/K假基因是C290T突变；1个肾癌病人携带的突变H2A/K假基因是A45G突变。然而在对照组的12个健康人中没有发现突变H2A/K非编码RNA。通过Fisher' s exact统计分析,我们发现这个结果是有统计学意义(Fisher's exact test, p=0.0007036),同时我们对突变的H2A/K长非编码RNA和细胞增殖之间是否存在联系而感兴趣。所以我们使用质谱蛋白质组shotgun方法,用胰酶酶解细胞蛋白成肽段,然后利用高效液相色谱-串联质谱来进行分析,用非标记定量软件对由质谱获得的数据进行蛋白质组定量分析,来研究突变的H2A/K长非编码RNA是否能影响细胞增殖。研究目的1.验证突变的H2A/K假基因是有活性的2.证明突变的H2A/K假基因能够促进细胞增殖研究方法1.肾癌组织H2A/K长非编码RNA-cDNA的PCR分析取30毫克肾癌组织样品,放入研钵中(液氮预冷)加入液氮研磨成粉末样,加入1毫升的,混匀后转入无RNA酶的1.5毫升EP离心管中,每管加入0.2毫升的氯仿,用振荡器震荡。以12000g在4℃离心机中离心15分钟,取100微升上清转入经0.1%DEPC水处理的1.5毫升EP管中,加入100微升的异丙醇沉淀。纯化后的RNA模板通过反转录试剂盒和引物5’-GGGATCCATGCAGGGCAGCA-3'反转录成cDNA,再用引物PF 5'-GGGATCCATGCAGGGCAGCA-3和引物PR5'-AGAATTCTCACTTGTATAGA-3'进行PCR扩增,之后亚克隆到PCDNA3.0质粒上进行测序。2.细胞培养、分子克隆和转染人肾细胞HEK293T被培养在改良的培养基DMEM中,培养基另外添加4.5克／升的葡萄糖和10%热灭活胎牛血清,在37℃含有5%二氧化碳的细胞培养箱中进行培养。四个分别表达H2A/K长非编码RNA(正常、C290T突变、C228A突变和A45G突变)质粒,是由来源于健康人和肾癌病人的cDNAs连接到pCDNA3.0上所构建。DNA转染使用Lipofectamine 2000转染试剂完成。简介步骤如下,质粒DNA与Lipofectamine 2000转染试剂以1微克／微升的比例,混合到无血清的DMEM培养基中,室温孵育15分钟,加入到培养的HEK293T细胞融合度达到60-70%的培养皿中,质粒在培养基中的最后浓度为8微克／毫升,放入细胞培养箱在37℃培养48小时。3.蛋白提取四个分别表达H2A/K长非编码RNA(正常、C290T突变、C228A突变和A45G突变)的质粒,分别使用Lipofectamine 2000转染试剂转染人。肾HEK293T细胞(每组4个10厘米大培养皿细胞,4组共16个10厘米大培养皿细胞),培养48小时后,经过PBS清洗的16个大培养皿中的细胞,分别被加入1毫升预冷带有cocktail蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液,用1毫升移液器完全吹打,然后分别把培养皿中细胞裂解混合液移入1.5毫升预冷的离心管中,放置冰上20分钟裂解,然后放入4度离心机中以13500g离心30分钟,取上清到新的预冷1.5毫升标记好的离心管中,用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度。4.蛋白溶液内胰酶酶解200微克的蛋白加入DTT到20mM摩尔浓度,置于56度还原30分钟去掉二硫键,加入IAA到50mM摩尔浓度,避光置于26度20分钟,保护已经被还原的二硫键。之后以1：30质量比加入质谱测序级胰酶,37度酶解20小时,然后用10k超滤管以15000g离心30分钟,超滤酶解的蛋白获得肽段,最后用ZipTip CJ18柱脱盐纯化肽段。5.高效液相色谱-串联质谱分析肽段上样前,每个样品用20微升0.1%甲酸溶解。肽段是采用高压液相色谱(HPLC, Thermo EASY-nLC System)分离,用电喷雾串联离子井质谱仪(Thermo LTQ Orbitrap Velos Elite, Thermo)测定肽段的质荷比进行分析鉴定。每一个肽段样品分析时,样品先经过碳18预分析柱,然后到碳18反相分析柱。肽段在碳18反相分析柱中用一个线性可溶梯度的液体(A相,0.1%甲酸水；B相,100%乙腈),以200纳升/分钟流速洗脱120分钟。一级质谱图谱是在离子井分析仪中,以质荷比300-1800范围60,000精确度获得,二级质谱是以碰撞诱导解离(CID)模式进行分析。对照组Q1以及三个突变组M_C290T、M_C228A和M_A45G的肽段样品各分析四次。6.组蛋白h2a(无h2a/k)表达蛋白的质谱数据分析来源于每个样品的二级图谱(CID)数据,使用蛋白质组分析软件(Proteome Discoverer 1.4)以2013年01月03日SWISS-PROT中人的蛋白质数据库为基础,进行蛋白搜索鉴定。7.应用MaxQuant软件进行蛋白质组定量分析对照组Q1以及突变组M_C290T, M_C228A和M_A45G的蛋白质谱分析数据(16个raw文件),通过著名MaxQuant(http://www.maxquant.org/)软件进行非标记蛋白质组定量分析,搜索的数据库为2013年01月03日SWISS-PROT中人的蛋白质数据。二级质谱(MS/MS)数据通过Andromeda搜索引擎搜索。每组蛋白样品定量分析基于四次生物学重复实验,对照组Q1以及突变组M_C290T、M_C228A和M_A45G四组共16个样品的蛋白定量,应用Welch's t test进行统计分析,当Welch'st test p0.05时被认为有统计学意义。对蛋白表达变化统计时,突变组蛋白表达丰度与对照组中相应蛋白表达丰度比值(Mutant/Q1)小于2倍的蛋白被抛弃。8.差异表达蛋白的生物信息学分析MaxQuant软件分析的对照组Q1以及突变组(M_C290T、M_C228A和M_A45G)组间差异表达蛋白数据,通过著名的PANTHER(http://www.pantherdb.org/)基因聚类软件分析,得到因H2A/K长非编码RNA突变表达而调整细胞蛋白功能分类的分析结果；同样,通过著名的STRING (http://www.string-db.org/)蛋白相互作用软件分析,得到因H2A/K长非编码RNA突变表达而调整的蛋白相互作用网络的分析结果。9.蛋白PCNA的Western blot分析Western blot分析由分别转染对照组Q1以及突变组M_C290T、M_C228A和M_A45G质粒的HEK293T细胞提取的蛋白来完成。用RIPA裂解液裂解细胞提取蛋白,每个样品各取50微克进行上样和SDS-PAGE凝胶电泳,然后电转到PVDF膜上,经5%BSA封闭,孵育一抗,用PBS洗三遍后孵育二抗,用Odyssey扫膜仪扫膜和进行灰度值分析。10.细胞增殖检测HEK293T细胞以2500个细胞／孔的密度种植在24孔板上孵育过夜,然后按之前转染步骤,按比例分别转染对照组Q1以及突变组M_C290T、M_C228A和M A45G质粒到各自3个孔的HEK293T细胞中,放入37度细胞培养箱中培养36小时。细胞增殖实验用EdU细胞增殖试剂盒来完成。按照EdU细胞增殖试剂盒操作步骤,用EdU染新增殖的细胞(红色)和用Hoechst 33342染全部细胞(蓝色),然后在荧光倒置显微镜下观察,使用Image-Pro Plus 6.0 (IPP 6.0)图像分析软件进行数字分析。11.统计学分析应用Fisher's exact test统计方法,对10个肾肿瘤病人和12个健康人中的突变H2A/K lncRNA进行统计分析,当p0.05时被认为具有统计学意义；应用Welch's t test统计方法对蛋白质组定量结果进行统计分析,当p0.05时被认为具有统计学意义。其他的定量分析应用Student'sttest进行统计分析,当p0.05时被认为具有统计学意义。定量数据由平均数±标准差来表示。研究结果1. H2A/K假基因能转录成长非编码RNAH2A/K假基因由于向5’端方向移码一个碱基,出现了终止子提前而不能正常翻译蛋白质,因而不是正常的组蛋白H2A基因。然而在一些肾癌组织样品中,H2A/K转录成长非编码RNA经反转录、PCR测序后能够被找到。2.细胞内表达突变H2A/K长非编码RNA分别转染四种质粒(表达正常H2A/K长非编码RNA或突变的H2A/K长非编码RNA:M_C290T、M_C228A或M_A45G)到HEK293T细胞。转染48小时后,收集被转染的HEK293T细胞,然后通过RNA提取步骤提取总RNA,进而对H2A/K长非编码RNA进行cDNA反转录和PCR扩增,应用引物‘'CATGGGAGACTACAAGGAC"对表达的H2A/K长非编码RNA进行测序。而在质谱分析的蛋白质组数据中,没有发现被转染的细胞(包括对照组和三个突变组)表达H2A/K蛋白。3.应用Shotgun和MaxQuant蛋白质组学方法分析突变H2A/K长非编码RNA调整细胞蛋白表达对照组Q1和三个突变组M_C290T、M_C228A和M_A45G每组各四份肽段样品,分别进行串联二级质谱分析。由shotgun质谱分析方法获得的质谱数据(raw文件),使用非标记定量软件MaxQuant进行蛋白质组定量分析。在分别表达正常和突变的H2A/K长非编码RNA各细胞组中,对照组Q1参与定量的蛋白数是403个,突变组M_C290T参与定量的蛋白数是320个,突变组M_C228A参与定量的蛋白数是259个,突变组M_A45G参与定量的蛋白数是309个。在突变组和对照组之间,具有统计学意义的差异表达蛋白数如下(Welch's t test, p value0.05):对照组Q1有296个,突变组M_C290T有193个,突变组M_C228A有191个和突变组M_A45G有177个。在突变组中蛋白表达下调(大于2倍)蛋白数如下：突变组M_C290T有28个下调,突变组M_c228A有29个下调和突变组M_A45G有37个下调。在突变组中蛋白表达上调(大于2倍)蛋白数如下：突变组M_C290T有147个上调,突变组M_C228A有142个上调和突变组M_A45G有108个上调。4.基因聚类分析显示突变H2A/K长非编码RNA促进细胞增殖在基因聚类分析中,H2A/K突变组中染色质蛋白表达的调整,与长非编码RNA能诱导染色质重塑的报导相一致。在三个突变组中,共同下调的染色质结合蛋白是凝集素亚单位SA-2(STAG2),STAG2是有临床意义的肿瘤抑制因子,这与一些长非编码RNA单核苷酸多态性参与肿瘤形成的之前发现相一致。同时,在突变组中多数的转录因子、翻译激活子和细胞增殖相互作用蛋白的表达上调,而且根据基因聚类分析发现,在突变组中,有非常多的参与生物合成、细胞运输、细胞过程和基础代谢的蛋白表达都发生上调。根据这些分析,可以推测突变的H2A/K长非编码RNA能促进细胞增殖。5.三个H2A/K突变组中PCNA-蛋白相互作用网络分析显示突变H2A/K长非编码RNA促进细胞增殖应用相互作用基因搜索软件Search Tool for the Retrieval of InteractingGenes (STRING) 9.0 database,对正常组Q1和突变组(M_C290T、M_C228A和M_A45G)之间差异表达蛋白的相互作用网络进行分析鉴定。这个蛋白相互作用通路分析揭示了一个以PCNA(增殖细胞核抗原)为核心的PCNA-蛋白相互作用网络,这个网络显示了与PCNA目互作用的许多上调蛋白之间有意义的相互联系。其中让人感兴趣的一点是,突变组中大多数与PCNA相互作用的蛋白可以促进肿瘤形成。四个表达上调的肿瘤形成蛋白,如PCNA、DNA结合蛋白A(CSDA)、热休克同源71 kDa蛋白(HSPA8)和依赖ATP的RNA解旋酶(DDX17)在三个突变组PCNA-蛋白相互作用网络中共同出现。9个肿瘤发生相关蛋白,如连环蛋白B 1(CTNNB1)、小泛素相关修饰蛋白2(SUM02)、核纤层蛋白-B1 (LMNB1).烯醇化酶1(ENO1)、78 kDa糖调节蛋白(HSPA5)、70 kDa热休克蛋白1A(HSPA1A)、线粒体60 kDa热休克蛋白(HSPD1)、细胞凋亡调节子BAX (BAX)和ATP依赖的RNA解旋酶A(DHX9),在2个H2A/K突变组PCNA-蛋白相互作用网络中共同表达上调。有四个肿瘤相关蛋白,即磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、输入蛋白亚单位-Q(KPNA2)、核仁素(NCL)和RNA结合蛋白FUS(FUS)的蛋白表达,只在一个突变组PCNA-蛋白相互作用网络里被调整。通过STRING软件对突变组PCNA-蛋白相互作用网络分析,发现PCNA-蛋白相互作用网络是以PCNA蛋白为核心,而且与PCNA相互作用的大多数表达调整的蛋白都与肿瘤发生相关。根据以上STRING生物信息软件分析发现,在三个突变组中,由突变H2A/K长非编码RNA引起的PCNA-蛋白相互作用网络能够促进细胞增殖。6. Western blotting确定PCNA蛋白在三个突变组(M_C290T、M_C228A和M_A45G)细胞中表达上调Western blotting分析是通过表达正常或突变H2A/K长非编码RNA的对照组Q1和突变组(M_C290T、M_C228A和M_A45G)细胞提取的蛋白而完成。Western blotting的分析结果显示,在表达突变H2A/K长非编码RNA的突变组(M_C290T、 M_C228A和M A45G)细胞中,细胞增殖标志蛋白PCNA表达上调。7.细胞增殖功能检验显示突变H2A/K长非编码RNA(C290T/U、C228A和A45G)促进细胞增殖按照EdU细胞增殖试剂盒(广州锐博EdU细胞增殖Kit)操作步骤,用EdU染新增殖的细胞(红色)和用Hoechst33342染全部细胞(蓝色),然后在荧光倒置显微镜下观察,使用Image-Pro Plus 6.0(IPP 6.0)图像分析软件进行数字分析,细胞增殖率用EdU细胞染色水平与Hoechst 33342细胞染色水平的比值表示。对照组Q1细胞增殖比率是0.134±0.003；突变组M C290T细胞增殖比率是0.453±0.086；突变组M_C228A细胞增殖比率是0.398±0.092和突变组M_A45G细胞增殖比率是0.388±0.070。结果显示为平均数±标准差,应用Student's t test检验进行统计分析,p值0.001(n=3),具有统计学意义。细胞增殖功能检验在细胞水平上也证明了突变H2A/K长非编码RNA(C290T、C228A和A45G)能够促进细胞增殖。讨论1.突变H2A/K长非编码RNA通过调节染色质结合蛋白和DEAD-box RNA解旋酶,增加细胞正常的转录活性从而促进细胞过程和细胞增殖。2.H2A/K假基因虽然不能表达正常组蛋白,但可以转录成长非编码RNA。3.我们使用了比较成熟的shotgun质谱分析方法和非标记定量蛋白质组学方法研究突变H2A/K,分析结果显示突变H2A/K长非编码RNA上调了许多原癌基因和下调了一些肿瘤发生抑制因子。使用生物信息学的基因聚类分析发现,突变的H2A/K长非编码RNA上调许多转录激活子、翻译激活子、生物合成过程蛋白和运输蛋白,从而促进细胞过程和细胞增殖。进一步的分析发现,在表达突变H2A/K长非编码RNA的细胞组中,以PCNA为中心的PCNA-蛋白相互作用网络里,大多数上调蛋白是肿瘤发生相关基因,这些基因的调整有利于促进细胞增殖。4.在定量蛋白质组的分子水平上和细胞增殖检测的细胞水平上,都证实了突变的H2A/K长非编码RNA(C290T、C228A和A45G)能促进细胞增殖。结论1.H2A/K假基因有生物活性。2.在非标记定量蛋白质组分子水平和EDU细胞增殖检测的细胞水平,都证明突变的H2A/K(M_C290T、M_C228和M_A45G)能促进细胞增殖
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q26
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本文编号：1462249