刀额新对虾过敏原的加工稳定性及特征肽的表征

发布时间：2018-12-09 13:52

【摘要】：食物过敏原标签是保护消费者免受过敏疾病危害的主要措施之一，而高通量、准确的检测方法是进行合理标注的关键。但由于对过敏原在食品加工过程中的变化认识不足，现有的过敏原检测方法存在假阴性率高，结果差异性大，难以应对不同加工食品中过敏原的检测。为了充分认识食品加工技术对过敏原的影响，并研究加工食品中过敏原的检测方法，本研究以甲壳类海产品中的刀额新对虾为研究对象，采用蛋白质组学和免疫学的技术原理研究其在食品加工过程中的变化规律，鉴定在食品加工过程中稳定存在的过敏原特征肽，为进一步研究过敏原的确证检测方法提供基础数据。主要研究结果如下： 1.选取冻干、烘干、凝胶和油炸4种常见食品加工方法处理的刀额新对虾作为研究对象，通过对虾肉蛋白质组分、免疫原性及抗酶解能力的分析，结果表明主要过敏原蛋白依然存在，免疫原性均有一定程度的下降，，其中经过凝胶处理的刀额新对虾过敏原与IgG结合能力下降可达87%，冻干处理对其活性影响最小，仅降低了6.8%；而加工对过敏原的抗酶解能力没有显著影响，主要过敏原在60min完全酶解，新产生的18.4kD蛋白在酶解30min时达到最大产量。 2.利用不同剂量的电子束辐照分别处理刀额新对虾虾肉组织、过敏原抽提液和纯化的过敏原，通过检测过敏原含量、免疫原性以及抗酶解能力的变化情况，研究电子束辐照对刀额新对虾过敏原的影响。结果表明，在低剂量辐照处理后，虾过敏原抽提液及纯化的过敏原与IgG结合能力降低幅度在10%以内，而肌肉组织中过敏原与IgG结合能力增强幅度可达20%；10kGy辐照处理后，过敏原抽提液与IgG结合能力降低了32.8%，纯化的过敏原降低了29.8%，肌肉组织中过敏原降低了27.3%；而辐照后的虾过敏原也在60min完全酶解，新产生的18.4kD蛋白在酶解30min时达到最大产量。 3.通过对刀额新对虾蛋白质进行双向电泳分离，并利用Melanie7.0软件对图谱展现的蛋白点进行分析，共检测到106个蛋白点，大部分蛋白点分布在等电点（pI）4.5-7和分子量（MW）20-90kD的区域。经加工处理的蛋白分布有显著性的差异，其中经过油炸处理后，pI5-6MW20-60kD区域的蛋白质明显缺失，凝胶虾丸处理的样品在酸性端分子量20kD附近产生了新的蛋白点，经过辐照处理后的样品在中性端30-50kD附近的蛋白点明显缺失，冻干处理对样品的影响最弱，与对照匹配蛋白点达68个，说明冻干样品对蛋白质的损失程度最弱。免疫印迹的结果显示，刀额新对虾共有11个蛋白点能够与血清中IgE结合，主要分布在pI4.5-7MW20-60kD区域。 4.将双向电泳分离、免疫鉴定的蛋白点进行酶解后，利用MALDI-MS和MALDI-MS/MS分析，结果采用Mascot搜索引擎在NCBInr数据库上进行搜索鉴定。其中，1号蛋白点优先匹配为刀额新对虾的主要过敏原Met e1，将其肽段信息通过BLAST工具进行相似性比对，发现Met e1与其它甲壳类以及节肢动物如螨虫、蜈蚣等的原肌球蛋白相似性72%，而肽段124Ser-Lys139具有特异性，唯一匹配为虾原肌球蛋白，可作为特征肽；4号蛋白点与磷酸丙酮酸水合酶和烯醇化酶两种蛋白相匹配，两种蛋白的相似度可达99%，其中肽段198Gly-Lys221与40多种物种的烯醇化酶相匹配，肽段273Ile-Arg279磷酸丙酮酸水合酶唯一匹配，可分别作为烯醇化酶的通用特征肽和磷酸丙酮酸水合酶的特征肽；而5号蛋白点与一种细菌（Runella slithyformis）的外膜外排蛋白的序列覆盖度达24%，其所有肽段与外膜外排蛋白唯一匹配，具有特异性。通过对刀额新对虾过敏原的加工稳定性研究发现，刀额新对虾主要过敏原Met e1具有较强的加工耐受性，并从中筛选得到肽段124Ser-Lys139可作为定量表征刀额新对虾过敏原的特征肽，可用于高准确度和灵敏度的虾加工产品过敏原定量检测方法的建立。
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【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：TS254.7

【参考文献】