基于NGS的Bacillus thuringiensis基因组和毒蛋白分析及毒蛋白信息平台构建

发布时间：2020-04-16 20:32

【摘要】：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种需氧,能够形成孢子的革兰氏阳性菌,在孢子形成的期间能够产生昆虫病原细菌伴孢晶体蛋白或δ-内毒素。这些Cry蛋白对多种害虫具有毒性,例如鳞翅目,鞘翅目,双翅目和线虫。苏云金芽孢杆菌被认为是最成功的微生物杀虫剂。此外,Bt毒素基因也已被有效地用于增强对昆虫害虫的抗性转基因作物。在过去的几十年里,Bt及其毒素是研究最多一种生物杀虫剂。然而,一些害虫正在逐渐地或已经对常用的基于苏云金芽孢杆菌的杀虫剂产生了的耐性,从而在某种程度上削弱了Bt类的杀虫剂的功效。因此,迫切的需要寻找具有不同的作用模式和特异性的Bt菌株和毒素蛋白,从而能够延续和提升这种细菌的杀虫活性。随着第二代测序技术的发展和新的组学概念的提出,更多的苏云金芽孢杆菌完成了全基因组测序和蛋白质组的质谱分析,为大规模高效率地识别新的菌株和新的毒素蛋白提供了前所未有的机遇。然而整合并且挖掘这些高通量的数据对于实验生物学家而言是一个重要挑战,因此有必要开发面向实验科学家的精确高效的数据库平台以及分析软件,系统的识别新的Bt毒蛋白。通过结合基因组比较分析能够更加深入了解芽孢杆菌属物种之间的基因组多样性以及不同的Bt亚种菌株之间的多样性,对深入理解苏云金芽苞杆菌的基因组特征和基因功能具有重要的意义。本实验室首先对从不同地域分离得到的6个Bt分离株进行全基因组测序,在该研究中,基于2016年6月之前公开的苏云金芽孢杆菌的基因组作为参考基因组,利用改进后的组装程序对scaffolds进行进一步的组装排序,构建了这6种菌株的基因组草图,并对基因组中的编码基因和蛋白质进行了预测和功能注释。通过功能注释分析,我们发现菌株中平均有56.3%的CDS能注释到相应的功能区域,通过对这6种苏云金芽孢杆菌分离株的基因组结构的分析,构建了Bt分离株基因组草图,和相应的基因组特征的分析,可以为后续的毒蛋白的识别提供一定的理论基础。其次,本研究中着重对比较感兴趣的苏云金芽孢杆菌菌株S2160-1的预测基因进行了功能分析,为后续的毒蛋白的识别奠定一定的理论依据。毒理试验表明S2160-1具有较高的灭蚊活性,为了识别和研究S2160-1菌株中的毒蛋白,将预测到的Bt S2160-1编码蛋白质与从公共资源中获取的653条毒蛋白氨基酸序列构建的数据库进行比对(e-value=0.00001)。S2160-1基因组中识别到了 46个候选毒蛋白基因。为了进一步对这些候选毒蛋白编码基因进行筛选,对这些预测毒蛋白进行了一级结构、二级结构和三级结构的分析。理化性质分析结果表明,这些预测毒蛋白长度变化范围在42～1216个氨基酸,蛋白质分子质量在4.86 kDa和137.28 kDa之间,蛋白质的等电点在4.3和10.06之间,其中pH大于7的蛋白质有16个。三级结构域和PFAM功能结构域分析结果表明,在质粒基因组中有13个候选毒蛋白具有典型内毒素结构域:Endotoxin N,Endotoxin_M,delta_endotoxin_C。因而推测,在Bt S2160-1菌株中可能具有13个编码毒蛋白基因,为了研究这些毒蛋白与已知的Bt毒蛋白之间关系,将11个已知的Bt菌株的90个编码毒蛋白基因与S2160-1的13个候选毒蛋白进行MEGA进化分析。通过进化分析,可以为S2160-1候选毒蛋白基因进行国际命名提供一定的参考价值,为候选毒蛋白的功能分析提供一定的理论基础。其次,为了比较这6种苏云金芽孢杆菌与其他已知的菌种和亲缘关系比较近的菌株间的关系,基于芽孢杆菌的三种不同的细菌菌种,基于公众发表的可获得的完整基因组序列。用于分析的菌株包括17个苏云金芽孢杆菌基因组,其中11个是从公众数据库中获得的,13个蜡状芽孢杆菌和8个炭疽杆菌的基因组。除了对每一种菌种进行了泛基因组和核基因组的分析外,还研究了包括17个苏云金芽苞杆菌、炭疽杆菌参考基因组和蜡状芽孢杆菌参考基因组的芽孢杆菌属的泛基因组和核基因组。事实证明在分析的三种菌种中所必须的基因的数目以及平均基因的数目相差不大,也进一步说明了这三种物种的亲缘关系比较近。但是也存在这一定的差异,通过基因组一致性分析表发现苏云金芽孢杆菌中,基因组的一致性得分与炭疽杆菌和蜡状芽孢杆菌相比较,整体是处于偏低的状态的,这也从另一个方面说明苏云金芽孢杆菌菌种对应的泛基因组和核基因组曲线变化比其余两种菌种的泛基因组和核基因组的曲线变化趋势强烈的原因。对苏云金芽孢杆菌和炭疽杆菌的核基因和泛基因进行直向同源的聚类组(COG)类的分布情况的不同再次对他们的泛基因组和核基因组进行比较分析。这项研究说明如何可已利用生物信息学工具对广泛的基因组进行简单比较的方法,通过已知的信息来深入的了解未知的现象。最后,本研究汇总了苏云金芽孢杆菌的公布的全基因组测序相关数据,以及我们实验室分离得到的菌株的基因组信息和蛋白质组数据构建了苏云金芽孢杆菌组学数据库Btomics,构建了基因组测序数据地分析平台,该数据库的构建为实验学者提供关门存储苏云金芽孢杆菌的基因组信息和其他的信息的查询。同时,本文还构建了苏云金芽孢杆菌的毒蛋白数据库,该数据库中通过人工挖掘和文献搜索的方式收集了所有的已知的毒蛋白的相关信息,而且还构建了基于序列相似性的毒蛋白预测软件。两个关于苏云金芽孢杆菌数据库的构建不仅能够为实验室的数据的提供存储和查询,而且有利于数据的交流共享以及实验科学家方便快捷地从事苏云金芽孢杆菌地生物信息学分析。
【图文】：

炭疽杆菌,功能注释,苏云金芽孢杆菌,基因组

ＣＯＧ数据库功能注释分析，大量蛋白质已经被分配到直向同源簇的功能类别。因此，逡逑接下来对炭疽杆菌和苏云金芽孢杆菌基因组的泛基因组和核基因组进行ＣＯＧ功能分逡逑析，并比较了这两个菌株的核和泛基因组基因对应ＣＯＧ功能统计分布情况（图４－７）。逡逑炭疽杆菌的ＣＯＧ功能统计分析如图４－７邋Ａ和Ｂ中的饼图。在底部，图例指定４个顶级逡逑ＣＯＧ类别：？？信息的存储和处理＇邋？？细胞过程和信号传导代谢”以及一些没有注释的逡逑ＣＯＧ类别，这四大类顶级ＣＯＧ类别又被分成２６个基因功能类，何是炭疽杆菌的泛基逡逑因组只注释到了邋１８个ＣＯＧ功能类。炭疽杆菌的完整泛基因组基因的ＣＯＧ功能分类逡逑（４－７Ａ）和保守核心基冈（４－７Ｂ）的ＣＯＧ功能注释。正如所预期那样，在泛基因组中逡逑功能不确定或根本无法进行功能预测的基因在泛基因组中占有较大的比例。这一部分基逡逑因约占泛基因组的５４％，包括没有同源基因、常见功能的预测分析以及功能未知的基逡逑因。但是这一部分基因中的部分基因从核基因组中移除，主要是由于这些基因在菌种之逡逑间的存在着变化，从而不存在核庙因组中。更让人惊讶的是，从饼图上来看，如果忽略逡逑灰色和黑色部分的话，，会发现泛基因组种的基因和核基因组种的基因几乎是很相似的分逡逑布在三种ＣＯＧ的三大功能类别中类别。相比泛基因组的基因功能的分布
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S476.1

【参考文献】