利用冷冻电镜技术解析富有挑战性的蛋白复合物原子分辨率结构

发布时间：2020-05-11 14:18

【摘要】：结构决定功能。结构解析是理解各种基本生命过程分子机制的重要途径。传统的结构解析方法如X射线晶体衍射学和核磁共振方法(NMR)已产生大量蛋白结构,极大丰富了我们对细胞中各种重要蛋白作用机制的理解。然而,由于需要对蛋白进行结晶,X射线晶体衍射学方法很难应用于不易体外表达或结晶的蛋白,尤其是一些重要的蛋白复合物和膜蛋白。核磁共振方法不但需要大量高纯度蛋白,而且只适用于小分子量蛋白。近年来随着技术进步,冷冻电镜方法逐渐成为蛋白原子分辨率结构解析的常规方法。冷冻电镜方法的优势是只需要极少量的蛋白样品,且对蛋白纯度要求不高。这里我展示冷冻电镜在解析富有挑战性的蛋白复合物结构中的两例成功应用。首先,我们使用冷冻电镜单颗粒技术解析CENP-LN复合物对CENP-A核小体特异性识别的分子机制。CENP-LN复合物对CENP-A核小体的识别是动粒组装过程的关键步骤,对有丝分裂中遗传物质的准确分离有重要影响。由于状态均一的CENP-LN/CENP-A核小体样品制备极其困难,研究人员未能通过X射线晶体衍射学方法获得该复合物高分辨结构。我们使用冷冻电镜单颗粒技术克服了样品组成及状态不均一问题,获得了整体分辨率5.8 A的CENP-LN/CENP-A核小体结构。我们发现CENP-N可以和CENP-A RG loop及核小体DNA相互作用从而特异性识别CENP-A核小体。我们进一步提出一种基于冷冻电镜成像的自下而上的结构蛋白组学方法,从含有多种内源蛋白复合物的样品中获得多个原子分辨率结构,以此来研究富有挑战性的生物系统。我们的方法直接从待研究的细胞匀浆(cellularmilieu)中富集多种内源蛋白,利用冷冻电镜单颗粒分析方法从头(ab initio)重构出多个近原子分辨率电镜结构,并完成蛋白序列鉴别、原子模型搭建。我们新开发的程序cryoID可从成千上万个候选序列中高效鉴别未知的冷冻电镜结构蛋白序列。我们将此方法应用于恶性疟原虫(malariaparasite Plasmoaium falciparum)并获得了对疟原虫在红细胞中存活有重要作用的多个蛋白复合物近原子分辨率结构,从而证明了该方法有效性。我们的结果表明,冷冻电镜单颗粒技术适于研究对传统方法构成极大挑战的蛋白复合物或生物系统。
【图文】：

第１章绪论逡逑１．１电子显微镜的诞生及在生命科学中的早期应用逡逑眼见为实——显微成像技术凭借其直观特性，是进行生命科学研宄尤其是微逡逑观层面研究不可或缺的工具。自发明以来，光学显微镜使得人们可以从细胞层面逡逑直接观察生物样品（如微生物、动物组织样本等），极大地促进了生命科学的发逡逑展。但由于光学衍射极限的存在，传统的光学显微镜所得到的最高分辨率约为光逡逑子的波长（几百纳米），很难应用于亚纳米尺度的蛋白功能相应的分子机理研宄。逡逑工欲善其事必先利其器。为在亚细胞层面乃至分子层面观察并理解生命过程，新逡逑的显微成像方法需要被开发出来。逡逑１．１．１电子显微镜的诞生逡逑

图１．１．２｜电子显微镜拍摄的生物样品图片（Ａ）桂藻Ａｍｐｈｉｐｌｅｕｒａｐｅｌｌｕｃｉｄａ电子显微镜下逡逑图片。ＨｅｉｎｚＯｔｔｏＭｉｉｌｌｅｒ和ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＫｒａｕｓｅ利用图１．１．１中电子显微镜拍摄。（Ｂ）噬菌体逡逑（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）电子显微镜下图片。由Ｈｅｌｍｕｔ邋Ｒｕｓｋａ利用电子显微镜拍摄。改编自（Ｅ．逡逑Ｒｕｓｋａ，邋１９８６）。逡逑电子显微镜被发明后很快应用于生命科学和医学研宄。Ｈｅｉｎｚ邋Ｏｔｔｏ邋ＭＵｌｌｅｒ和逡逑ＦｒｉｅｄｒｉｃｈＫｒａｕｓｅ利用Ｅｒｎｓｔ邋Ｒｕｓｋａ在１９３３年建造的电子显微镜拍摄了一系列生物逡逑样品，包括家绳翅膀、硅藻、微生物等，，并不断获得更好的结果。挂藻Ａｍｐｈｉｐｌｅｕｒａ逡逑ｅｌｌｕｃｉｄａ（ｔｒａｎｓａｉｃａｌ邋ｓｔｒｉａｅ）在光学显微镜下无法分辨，但在电逡逑
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q51

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本文编号：2658583