基于微电极阵列与原子力显微镜联合的细胞生理活动多参数检测技术的研究

发布时间：2018-03-01 09:24

本文关键词： 神经细胞心肌细胞微电极阵列原子力显微镜电机械信号检测光解笼锁可塑性药物筛选细胞培养　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：电活动和力学活动在可兴奋细胞如心肌细胞和骨骼肌细胞的生理功能中扮演着重要角色。本文以心肌细胞为例来研究能够同时记录细胞电活动和力学活动的电机械信号检测方法。在心肌细胞中,电生理活动和力学活动是紧密关联的。心肌细胞产生动作电位的过程使胞内钙离子浓度迅速增大,钙离子直接参与到心肌细胞的收缩活动中。另外,心肌细胞的力学活动对其电生理活动具有反馈作用。心肌细胞的收缩张力会对肌丝的钙离子敏感性以及细胞膜上的机械敏感性离子通道产生影响,从而影响心肌细胞的电活动。对心肌细胞的电活动和力学活动同时进行检测有助于了解心肌细胞在生理和病理状态下的工作机制。一方面,心肌细胞电机械活动的检测可以更全面地考察心血管药物的作用效果,为药物筛选提供一种高效的手段。细胞在药物作用下的电生理活动参数如电发放频率和动作电位时间长度的变化已经成为评价药物作用的指标。与此同时,心肌细胞的力学活动参数如收缩力的大小和收缩——舒张周期的长短也被用于药效评价。对于一些药物来说,在其浓度较低的情况下,心肌细胞的电生理活动变化不明显而力学活动则明显增强。将细胞的电活动检测与力学测量相结合有助于提高药效评估的准确性和效率。另一方面,心肌细胞的数学模型为深入理解心肌细胞的工作机制提供了有力工具,并且在虚拟教学、疾病治疗效果的评价等方面有广阔的应用前景。较早发展起来的心肌细胞电生理模型主要在细胞膜离子学说基础上描述心肌细胞动作电位的产生过程。另外,描述心肌细胞力学活动的数学模型也被建立起来。以上两种模型在心肌细胞研究中都具有重要价值。然而,仅仅针对心肌细胞电活动和力学活动之一进行建模不能完全反映心肌细胞的生理功能。为此,有研究者将上述两种模型结合起来建立了心肌细胞的电机械模型。这种模型的建立和完善需要大量的同时包含细胞电学和力学信息的实验数据,而细胞电机械信号检测方法可以为数据采集过程提供支持。由于以上两方面的原因,发展一种高效的细胞电机械信号检测方法是一项很有意义的工作。本文提出了一种结合微电极阵列电信号采集技术与原子力显微镜力学测量技术为一体的细胞电机械信号检测方法,并验证了该方法的有效性。本文的主要研究内容如下:(1)描述了细胞电活动和力学活动产生的结构基础,介绍了神经细胞和心肌细胞动作电位的产生过程和各自的特点,分析了心肌细胞的电力学耦合机制,最后阐述了细胞电机械信号检测方法研究的意义和重要性。(2)回顾了现有的细胞电生理信号和力学信号检测技术,介绍了微电极阵列胞外电信号采集技术的发展和应用,另外还对原子力显微镜这一力学测量工具的原理、发展过程和生物学应用进行了叙述。(3)以神经细胞为研究对象,利用微电极阵列对可控生长的嗅球神经细胞网络进行电信号采集。首先,制作了一种带有微结构的细胞培养器件并对器件表面进行改性处理。将嗅球神经细胞培养在该器件上,通过微结构和器件表面特性来控制神经细胞的生长,从而形成具有固定连接方式的细胞网络。对网络中的嗅球神经细胞进行了免疫化学鉴定。通过将细胞培养器件与微电极阵列相结合采集了网络中神经细胞的电信号。分析了实验结果和实验中存在的问题。(4)采用原子力显微镜对神经活动诱导的细胞形态学变化进行检测。搭建了细胞力学检测平台。为了验证这一平台在活细胞检测中的可行性,以大鼠皮层神经元的可塑性为考察对象,分析了以往研究中神经细胞刺激方法和形态学检测手段的不足,提出了将光解笼锁刺激和原子力显微镜扫描成像结合起来检测神经活动导致的细胞结构变化这一方法。观察了不同条件下解笼锁药物分子的作用区域随时间的变化情况,确定了合适的刺激参数。分别对不同条件下的4组神经细胞进行了测试。对实验结果和实验过程的优缺点进行了分析和讨论。(5)将微电极阵列与细胞力学测量平台相结合,对心肌细胞的电机械活动进行检测。介绍了心肌细胞电机械信号检测的研究背景,描述了现有的细胞电机械信号检测方法,分析了这些方法的不足,提出将微电极阵列与原子力显微镜相结合的实验方案。在微电极阵列芯片上培养心肌细胞。利用微电极阵列和原子力显微镜的联合平台,同时记录了心肌细胞的电生理活动和力学活动。分析了心肌细胞电信号和力学信号的关联。为了验证实验平台在药物筛选中的有效性,记录了心肌细胞在肾上腺素等药物作用前后的电机械活动。通过对细胞电发放间隔时间和横向力大小的分析考察了药物作用效果。测定了心肌细胞收缩力和刺激频率关系曲线。讨论了实验结果和实验过程的不足。在本文提出的检测平台的基础上,一些细胞生物学中的基本问题可以得到深入研究。多个心肌细胞如何通过力学或者电学信号的感知来实现一致的生理活动节律是一个有趣的课题。通过AFM探针对心肌细胞施加特定大小的作用力并采用MEA记录细胞电生理信号,我们可以研究作用力的大小与细胞静息电位、复极化时间之间的定量关系。利用AFM探针对心肌细胞施加频率和大小可控的力学刺激,可以使细胞的生理活动节律最终与力学刺激的频率一致。在这个过程中,研究者可考察力学刺激幅值、作用的时间模式对生理活动的影响。将心肌细胞培养在弹性模量不同的基底材料上,通过细胞电机械活动的长时间记录来探究心肌细胞的力学环境对其特定基因表达、蛋白合成和收缩——舒张功能的影响。同样,如果对心肌细胞施加持续的变化的电场,我们同样可以研究电场变化对心肌细胞生理活动的影响。单纯的心肌细胞培养体系和心肌细胞——成纤维细胞共培养两种体系中,细胞的电机械活动特征(收缩频率、收缩力大小)是否不同,导致这些差异的分子机制也可以通过本文提出的细胞检测平台进行探索。有研究表明心脏中间层细胞和心脏内层细胞具有不同的生理特性,如果将心脏中不同部位的细胞准确区分并分别进行培养,利用细胞电机械测量平台对这些细胞的电机械特性进行定量表征,将所得数据用于心脏数学模型的构建,那么,这些模型对心脏在生理或者病理状态下的活动情况可能给出更精确的描述。利用本文提出的细胞电机械活动检测平台,我们可以将细胞电学特性(细胞膜的电容、电阻等)测试和力学特性(弹性模量等)测试相结合,从而对正常细胞和肿瘤细胞进行鉴别,为癌症的诊断、治疗和疗效评估提供可能的途径。本文提出的实验平台具有对单个细胞同时施加力学、电学和生物化学刺激的能力。最近的研究表明机械刺激可以影响细胞微环境,诱导干细胞分化,影响细胞形态和肌动蛋白骨架的重构。另外,电刺激在心肌组织的传导、收缩功能的发育过程中具有重要作用。对细胞同时施加电学、力学和化学刺激对于在体外重建肌细胞的生理微环境是必要的。尤其对于心肌细胞来说,在体内环境下,心肌组织所感受到的电学和力学刺激是紧密耦合在一起的。多参数细胞刺激和检测平台可以为考察某一种刺激或者几种刺激协同作用对细胞发育、分化和细胞功能的影响提供有力工具,对组织工程和再生医学的发展具有一定的促进作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TN911.23;R318

【相似文献】