基于光片照明的光场显微成像系统
发布时间：2020-08-13 22:18
【摘要】：本文介绍了一种高时空分辨率的三维显微成像系统。该系统具有多功能性,可以根据不同的生物研究需要切换不同的成像模式,完成相应的成像要求。该系统结合了光片荧光显微镜与光场显微镜的优势,通过将光片照明的方式引入光场成像,提高了光场显微镜的成像性能,实现了对厚样品生物动态过程的实时三维成像,拓展了光场显微镜的应用领域。该系统依托商用的奥林巴斯BX-51正置显微镜设计并实现。在保留原有显微镜功能不改变的同时,可以实现在光片荧光显微镜和光场显微镜之间的切换。通过小型化、模块化的设计,使得系统具有较小的体积,易于搭建和推广。同时,保留了一定的可拓展性。可以根据不同的需要对系统进行拓展。该系统可以实现细胞级别的分辨率和高达100FPS的体成像速率,解决了生物成像问题中对分辨率、成像速度以及通量的需求。并从现实的生物应用出发,以秀丽隐杆线虫和斑马鱼心脏为例,实现了高分辨率的线虫成像、线虫运动过程和斑马鱼心脏跳动过程的三维重构,分析了其在生物研究中的作用和意义。该系统的设计从现实的生物医学问题出发,旨在为相关生物医学领域研究者提供一种有力的、易于使用的工具,为显微成像技术的发展提供一种新的思路。希望该系统通过不断地改进,能够得到广泛的应用。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TP391.41;TH742
【图文】：
领域中获得了广泛的应用[9-12]。传统的落射式宽场荧光显微镜采用落射式的宽场照明方式，照明光路与探测光路部分重合，照明光经由物镜聚焦于样本上激发荧光，所激发的荧光信号再经由物镜成像[5, 13, 14]，如图 1-1(a)所示。虽然激发光的波长与发射光的波长不同，经由滤色块滤波后，两者并不会互相干扰。但是位于照明探测光路上的样本荧光均被激发，在最终所成的荧光图像上，非焦平面上的信号所产生的离焦图像会对有效的焦面信号产生干扰，从而降低图像的信噪比和分辨率。对诸如鼠脑、斑马鱼等大样本成像时，宽场照明所带来的图像降质尤为严重和明显，在最终的图像中甚至不能分辨出有效的结构和细节信息。对于三维成像而言，一般的方法是沿探测方向对整个样本进行扫描，分别在不同的焦平面上进行成像，最后将所成图像堆叠重构成样本的三维图像。对于较大的样本，扫描需要耗费较长的时间。采用落射式照明的宽场显微镜在三维成像中，由于样本在整个三维成像的过程中都处于被激发的状态，长时间的照明会导致样本荧光信号的漂白，同时较强的光毒性容易导致活体样本的死亡，不利于对活体样本进行三维成像。
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文常规的光场显微镜如图 1-2(a)所示，放大区域为微透镜阵列。一般的宽场探测仅能够探测光的强度信息，对点光源进行成像时，仅在焦平面上可以探测到最小的光斑(艾里斑)，而在不同的离焦位置则探测到半径不同的扩散斑。而添加了 MLA 之后，不同角度光线经由 MLA 会打在探测器的不同位置上。因而处在不同焦平面的点除了在扩散大小上有差异，其所呈现的形状也有算不同，如图 1-2(c)所示。通过去卷积或光场渲染等方法即可恢复所探测的三维图像信息[13, 19, 21, 22]。图 1-2(d)对比了宽场探测与光场探测沿 z 轴的成像结果。
渲染等方法即可恢复所探测的三维图像信息[13, 19, 21, 22]。图 1-2(d)对比了宽场探测与光场探测沿 z 轴的成像结果。图 1-2 (a)常规的光场显微镜.[22] (b)宽场探测示意图. (c)光场探测示意图. Sensor:探测器. FP:物镜焦平面. OBJ:显微物镜. TL:显微镜筒镜. MLA:微透镜阵列. (d)样品处于不同轴向位置时,宽场探测与光场探测的成像结果对比.左列为宽场探测结果,右列为光场探测结果.光场显微镜仅需通过单次曝光即可恢复出样品的三维信息，相比较光片显微镜或共聚焦显微镜通过扫描重构三维图像的方式而言在成像速度上具有极大的优势，特别适用于拍摄活体样本的三维运动过程或三维信号的变化过程。但对角向信息的提取增加势必导致所提取到的强度信息的减少，光场显微镜的横向分辨率与轴向分辨率是相矛盾的关系，其横向分辨率主要决定于所使用 MLA 的透镜元大小、显微系统的放大倍率和波长，其在轴向上的分辨率分布也并非各向同性。横向分辨率的经验公式为[22]：υ(z) = 0.94 | |
本文编号：2792603
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TP391.41;TH742
【图文】：
领域中获得了广泛的应用[9-12]。传统的落射式宽场荧光显微镜采用落射式的宽场照明方式，照明光路与探测光路部分重合，照明光经由物镜聚焦于样本上激发荧光，所激发的荧光信号再经由物镜成像[5, 13, 14]，如图 1-1(a)所示。虽然激发光的波长与发射光的波长不同，经由滤色块滤波后，两者并不会互相干扰。但是位于照明探测光路上的样本荧光均被激发，在最终所成的荧光图像上，非焦平面上的信号所产生的离焦图像会对有效的焦面信号产生干扰，从而降低图像的信噪比和分辨率。对诸如鼠脑、斑马鱼等大样本成像时，宽场照明所带来的图像降质尤为严重和明显，在最终的图像中甚至不能分辨出有效的结构和细节信息。对于三维成像而言，一般的方法是沿探测方向对整个样本进行扫描，分别在不同的焦平面上进行成像，最后将所成图像堆叠重构成样本的三维图像。对于较大的样本，扫描需要耗费较长的时间。采用落射式照明的宽场显微镜在三维成像中，由于样本在整个三维成像的过程中都处于被激发的状态，长时间的照明会导致样本荧光信号的漂白，同时较强的光毒性容易导致活体样本的死亡，不利于对活体样本进行三维成像。
华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文常规的光场显微镜如图 1-2(a)所示，放大区域为微透镜阵列。一般的宽场探测仅能够探测光的强度信息，对点光源进行成像时，仅在焦平面上可以探测到最小的光斑(艾里斑)，而在不同的离焦位置则探测到半径不同的扩散斑。而添加了 MLA 之后，不同角度光线经由 MLA 会打在探测器的不同位置上。因而处在不同焦平面的点除了在扩散大小上有差异，其所呈现的形状也有算不同，如图 1-2(c)所示。通过去卷积或光场渲染等方法即可恢复所探测的三维图像信息[13, 19, 21, 22]。图 1-2(d)对比了宽场探测与光场探测沿 z 轴的成像结果。
渲染等方法即可恢复所探测的三维图像信息[13, 19, 21, 22]。图 1-2(d)对比了宽场探测与光场探测沿 z 轴的成像结果。图 1-2 (a)常规的光场显微镜.[22] (b)宽场探测示意图. (c)光场探测示意图. Sensor:探测器. FP:物镜焦平面. OBJ:显微物镜. TL:显微镜筒镜. MLA:微透镜阵列. (d)样品处于不同轴向位置时,宽场探测与光场探测的成像结果对比.左列为宽场探测结果,右列为光场探测结果.光场显微镜仅需通过单次曝光即可恢复出样品的三维信息，相比较光片显微镜或共聚焦显微镜通过扫描重构三维图像的方式而言在成像速度上具有极大的优势，特别适用于拍摄活体样本的三维运动过程或三维信号的变化过程。但对角向信息的提取增加势必导致所提取到的强度信息的减少，光场显微镜的横向分辨率与轴向分辨率是相矛盾的关系，其横向分辨率主要决定于所使用 MLA 的透镜元大小、显微系统的放大倍率和波长，其在轴向上的分辨率分布也并非各向同性。横向分辨率的经验公式为[22]：υ(z) = 0.94 | |
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 聂云峰;相里斌;周志良;;光场成像技术进展[J];中国科学院研究生院学报;2011年05期
本文编号：2792603
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