基于贝塞尔光束扫描的光片荧光显微技术研究

发布时间：2021-08-13 23:16

　　光片荧光显微用一层光束薄片从侧面激发样品,并在垂直于光片的方向上用显微物镜和相机拍摄样品荧光图像,通过轴向扫描光片或移动样品逐面成像,获取不同深度处的层析图像并实现样品三维信息重构。与共聚焦显微技术相比,光片荧光显微因具有三维层析成像速度快、光漂白弱和光毒性小等优点成为了生命科学领域中重要的三维成像工具。目前光片荧光显微系统大多使用高斯型光片场,大视场观测需以牺牲图像质量和轴向分辨率为代价。扫描贝塞尔光束生成的光片虽然能扩大观测视场,但它的同心环状旁瓣会产生较强的离焦背景,降低图像信噪比和轴向分辨率。如何在不损失轴向分辨率的前提下扩大光片荧光显微成像系统的观测视场是光片荧光显微技术中亟待解决的问题。本文提出并生成了贝塞尔光束的互补光束,分别扫描贝塞尔光束和互补光束拍摄荧光图像,取其强度差值可以得到去除离焦背景的荧光图像,从而实现高时空分辨率、大观测视场的荧光三维显微成像。本文主要研究工作包含以下几方面:1、设计并优化了贝塞尔光束的互补光束。针对贝塞尔光片旁瓣激发离焦背景的问题构想出一种贝塞尔光束的互补光束,其扫描光片场恰好是贝塞尔光片的旁瓣部分。研究了贝塞尔光束和马丢光束等无衍射光束频... 

【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院西安光学精密机械研究所)陕西省

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【学位级别】：硕士

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绿色荧光蛋白结构与种类(a)绿色荧光蛋白1GFL的结构图，来自TheProteinDataBank(PDB)(b)绿色荧光蛋白和红

[7]Figure 1.2 Schematic of Confocal Laser Scanning Microscope从图1.2c可知，层析能力提高的CLSM技术仍不能实现各向同性的分辨率。与 CLSM 技术滤除离焦背景信号的思路相比，另一种相反方案是抑制离焦部分荧光蛋白发射荧光。这正是受激发射抑制（Stimulated Emission Depletion，STED）技术的构想[8]。用高强度的红外 STED 光同步照射被激发光斑照明的区域，被激发处于S1能级的荧光蛋白因为在 STED光的作用下受激辐射发出红外光回到 S0能级的过程压过了自发辐射发出荧光的过程而不能发出荧光。通过构造 STED 光的空间分布可以使其构成一个中空的分布，即中间部分不会诱发荧光蛋白受激辐射，中间仍发出荧光；外围由于受激辐射的作用荧光发射被抑制。加大 STED 光的光强，其对荧光的抑制作用会进一步向中空区域收缩，最终导致只有超越衍射极限级别的球形区域才能发出荧光。另一种基于点扫描三维成像技术为双光子激光扫描荧光显微技术[9-10]。相比于单光子的线性激发

第一章 绪论处于基态的荧光蛋白需要连续（0.5 飞秒之内）吸收两个能量相同的光子实现跃迁，且两个能级的能量差要刚好等于两个光子的能量之和。之后荧光蛋白经过非辐射的弛豫过程后自发辐射出一个荧光光子回到基态。若要观察到该过程，需要用飞秒激光器发出的高功率红外脉冲光激发荧光蛋白。


本文编号：3341310