利用催化发夹组装的生物传感器检测目标DNA和人源性α-凝血酶

发布时间：2018-07-14 16:36

【摘要】：目的:肿瘤相关DNA存在于患者的血液、唾液、尿液和其他分泌液中,与正常DNA相比,其往往会发生碱基突变,而检测目标DNA的碱基突变有助于肿瘤的筛查和肿瘤远处转移的检测。由于肿瘤早期体液中的肿瘤DNA表达量很少,因此,寻找一种灵敏、特异的识别方法用于检测目标DNA的浓度对早期诊断肿瘤有着非常重要的意义。α-凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶,它主要参与血液凝血过程,有促凝和抗凝的双重作用,其在体内的异常表达与血栓性疾病的发生直接相关。然而,目前用于α-凝血酶的检测方法却存在操作繁琐、试剂价格昂贵、不够灵敏等问题。本研究利用串联的分支整合DNA耦合催化发夹组装反应(CHA)制成的生物传感器可直接检测目标DNA以及人源性α-凝血酶,同时,对传感器的可行性、灵敏度和特异性进行了分析。方法:1.串联体分支整合DNA的形成:目标物分子存在的条件下,打开第一条DNA发夹H1,H1暴露出能打开发夹H2的序列并打开发夹H2,H2暴露出的序列打开发夹H1进入下一个循环,最终形成一系列串联体分支整合DNA。当缺乏目标物时,2种发夹DNA独立存在于同一体系中,相互之间不发生反应。2.CHA反应:串联体分支整合DNA上含有自由的紧密靠近的触发链,可触发CHA的发生。由于一个目标物分子可引发一条串联分支整合DNA链形成,而一条分支整合DNA链含有多个触发链,从而触发多个CHA反应,实现第一次信号放大。3.类过氧化物酶催化底物反应和信号进一步放大:CHA发生后,每一条双链DNA产物末端都含有G-四聚体结构,当加入血红素后,G-四聚体被激活并具有类过氧化物酶的活性。在过氧化氢存在下,其催化ABTS发生氧化还原反应,从而在418 nm处形成特征性吸收峰。4.可行性分析:利用非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外可见分光光度计表征可行性。5.传感器检测的条件优化及性能评价:对H1与目标DNA之间互补碱基的长度、H2与H3浓度、CHA的孵育时间和孵育温度进行优化;对传感器的灵敏度、特异性进行评价。结果:1.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,分步的串联体分支整合DNA反应以及CHA反应可行。紫外可见分光光度计进一步证明目标物分子引发串联体分支整合DNA反应,进而由串联体上的引发物链引发CHA的一体化反应可行。2.目标物分子加入后触发信号放大反应体系,产生的具有类过氧化物酶活性的G-四聚体DNAzyme催化底物并在418 nm处产生特征性吸收峰,根据吸收峰强度随浓度的变化制定了标准曲线。3.基于串联体分支整合DNA及CHA的传感器性能:检测目标DNA分子的线性范围是1.0 p M到75 n M,检测下限为0.14 p M(S/N=3);检测人源性α-凝血酶的线性范围是1.0 p M到2.5 n M,检测下限为0.68 p M(S/N=3);具有单碱基突变识别能力。结论:本实验研究利用串联体分支整合DNA及CHA构建了一种新的生物传感器检测目标DNA分子以及人源性α-凝血酶,在这一反应体系内,比色反应的灵敏度得到显著提高;在近端错配识别的作用下,展现出了很高的特异性,实现了单碱基错配识别性能;和传统比色实验相比,本实验设计的传感器具有低检测限、高特异性、操作简便,无需冲洗等步骤;本传感器在临床生物医学研究,肿瘤标志物检测,法医检测中具有很高的应用潜力。
[Abstract]:Objective : To study the feasibility , sensitivity and specificity of DNA . 1 . The results of non - denaturing polyacrylamide gel electrophoresis show that the branched integration of DNA and CHA is feasible . The UV - Vis spectrophotometer further proves that the target molecule - induced tandem branch integrates the DNA reaction , and then the detection limit is 0 . 14 p M ( S / N = 3 ) . The detection limit is 0 . 14 p M ( S / N = 3 ) .
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TP212.3;R446

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