基于有机多孔材料及导电杂化纳米材料构建C-反应蛋白及单核苷酸多态性传感器的研究

发布时间：2020-03-26 04:32

【摘要】：近年来,对新材料的研究持续成为热点,涌现出各种各样具有特定功能的高性能材料。有机多孔材料(porous organic polymers,POPs)中,共价-有机框架材料(Covalent-organic frameworks,COFs)和金属-有机框架材料(Metal-organic frameworks,MOFs)是近几年新发展起来的两种新型材料。由于其具有结构的多样性、灵活的可操作性、框架密度低以及化学可修饰性强等特点,在生物医学、生物传感以及癌症的诊断和治疗等领域有较好的应用前景。导电杂化纳米材料是几种纳米材料的结合,其性能优于每种单独的纳米材料。由于其具有大面积特异性界面和良好的电导率,导电杂化纳米材料在电化学免疫传感器的制备中具有许多优势。根据以上材料的特点,本文合成了负载金纳米颗粒的共价有机框架材料(Au NPs@COF-TpPa-1、Au NPs@COF-LZU8)、镉金属有机框架材料(Cd-MOF)、钴金属有机框架材料(Co-MOF)、负载金纳米颗粒的类石墨相氮化碳(Au NPs@g-C_3N_4)、离子液体功能化的二硫化钼(IL-MoS_2)、负载铱纳米颗粒的1,5-二氨基萘(DN)功能化的石墨烯(Ir NPs@GO-DN)等复合材料,并将其用于构建C-反应蛋白传感器和单核苷酸多态性传感器。(1)纳米模拟酶作为一类极具发展前景的功能材料而广受关注,Co_3O_4具有模拟过氧化氢酶的性质,对H_2O_2的还原有较好的催化作用。Au NPs@COF-TpPa-1具有较大的比表面积及良好的蛋白吸附性,本实验中采用Au NPs@COF-TpPa-1固定C-反应蛋白抗体,氨基化后的Co_3O_4标记C-反应蛋白抗体,构建了一种新型夹心法C-反应蛋白传感器。通过计时电流法(i-t)检测H_2O_2的还原电流,所测的电流与CRP的浓度在0.05-80 ng/mL内具有良好的线性范围,相关系数R2=0.9955,检出限为16.7 pg/mL。该传感器的响应能力、灵敏度较好。(2)Au NPs@COF-LZU8具有高电导率,本实验将其作为基底固定CRP抗体,构建了一种检测迅速、灵敏度高的无标记型电化学免疫传感器,实现其在实际血清样品中对C-反应蛋白(CRP)的测量。当抗体与抗原发生免疫反应时,形成的免疫复合物会阻碍电化学探针[Fe(CN)_6]~(4-/3-)的电子传递,降低其响应电流,从而实现CRP的快速检测。此外,Au NPs@COF-LZU8具有丰富的吸附位点和较大的比表面积,可以通过提高抗体的负载量来改善免疫传感器的性能。在最优实验条件下,此电化学免疫传感器的线性范围从0.1 ng/mL-200 ng/mL,相关系数R2=0.9913,检出限为33.3 pg/mL,将此免疫传感器用于在人血清样品中CRP的检测,此方案也可用于其它蛋白质的分析。(3)导电杂化纳米材料Au NPs@IL-MoS_2具有较大的比表面积及良好的导电性,Ir NPs@GO-DN复合材料对H_2O_2的还原有较好的催化效果。基于以上几点,本章以Au NPs@IL-MoS_2固定CRP抗体、Ir NPs@GO-DN标记抗体,构建了一种新的夹心型CRP传感器。此电化学免疫传感器的线性范围0.01-100 ng/mL,相关系数R2=0.9931,检出限为3.3 pg/mL,该方法显示出良好的灵敏度,为C-反应蛋白的检测提供了一种新的手段。(4)在人类基因组大约30亿碱基中,大约每1000个碱基就有一个碱基可能发生突变,可能引起它所编码的蛋白质结构与功能发生异常,导致疾病的发生。因此,对特定序列DNA的检测与突变碱基的有效识别,即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测技术,具有十分重要的意义。在第五章中,构建了基于功能化金属有机框架材料的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)DNA传感器,并利用杂交链反应进行信号放大,增加传感器的灵敏度。本工作利用Au NPs@GO所具有的较大的比表面积,通过Au-S键的结合力将3’端带有巯基的捕获探针(Capture probe)固定在修饰了Au NPs@GO电极上。实验制备了镉金属有机框架材料(Cd-MOF),并在其表面修饰了金属纳米粒子(Au NPs)和亲和素(SA)。所合成的Au NPs@Cd-MOF/SA复合物材料通过生物素(biotin)修饰的信号探针(signal DNA)组装在电极表面。并且,所合成的Cd-MOF还具有电化学活性,可以作为信号标签输出电化学信号。通过差分脉冲伏安法(DPV)检测镉离子的电流信号峰,从而实现对目标DNA S1的定量检测。此电化学SNP传感器的线性范围0.001-10 pmol/L,相关系数R2=0.9790,S1的检出限为0.33fmol/L,该方法显示出良好的灵敏度,具有临床应用的潜力。(5)SNP不仅认为是癌症相关药物代谢或反应性研究的遗传标记,也是鉴定遗传性致病基因的基本工具。在第六章中,为了进一步提高SNP检测的灵敏度用于临床疾病诊断的研究,本实验构建了基于DNA纳米机器(DNA Walkers)的信号放大型SNP DNA传感器。DNA Walkers通过功能化的Au NPs@CoFe_2O_4和精心设计的核苷酸序列得以构建。在传感器的制备上,利用Au NPs@g-C_3N_4具有较大的比表面积和Au-S键的结合力将3’端带有巯基的捕捉探(Capture probe)固定在电极上。此外,我们还制备了钴金属有机框架材料(Co-MOF),所制备的Co-MOF具有良好的电化学活性,可以作为信号标签输出电化学信号。本工作设计了信号放大策略,该策略可以通过信号探针(Signal probe)和辅助探针(Auxiliary probe)互补杂交循环,从而实现信号放大。此电化学SNP传感器的线性范围为0.0001-0.1 fmol/L,相关系数R2=0.9796,目标DNA(Target DNA)的检出限为0.033 amol/L。
【图文】：

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图 1.1 基于共价-有机框架传感器的制备流程图[14]1.1.3 金属-有机框架及其在传感器方面的应用金属-有机框架（Metal-Organic Frameworks, MOFs），是由有机配体和金离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料[15]绝大多数 MOFs 以水热或溶剂热法合成，是指在密封的压力容器中，以水为剂，在高温高压的条件下进行的化学合成方法。由于 MOFs 具有可控的孔径大小、不饱和的金属位点、功能基团以及良的生物兼容性，在固定化基质方面有应用前景，因为即使在非自然环境（高温溶剂）下 MOFs 也能长期保持固定化酶的生物活性和稳定性[16]。在 MOFs 特中，它们的杂化性质和多峰孔隙度已成为成功生物催化的关键参数，因为它给予有效的质量传递，并最终实现辅助因子的共同作用。当用作模板/前体时MOFs 可以转化为比原始 MOFs 更稳定、导电性更强的基于碳/金属的多孔材料

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图 1.2 基于金属-有机框架传感器的制备流程图[24]1.2 导电杂化纳米材料1.2.1 导电杂化纳米材料概论贵金属、碳、导电有机纳米材料和化学可改性聚合物是纳米材料杂化物最常用的成分，如 Au NPs@石墨烯和壳聚糖改性的 Au NPs。通过逐层或原位生成方法将不同的纳米材料结合在一起。纳米杂化材料的特性是每种纳米材料的结合，甚至优于单独的各种纳米材料[25]。石墨烯、二硫化钼等二维纳米材料在物理、化学和力学方面拥有许多优异的性能。但是，二维材料在某些特定环境下单独使用时仍存在许多需要改善的不足与局限，，这些情况限制了二维纳米材料的广泛应用。例如，层与层之间作用力容易发生二次堆叠；因其表面的惰性，石墨烯很难均匀分散在聚合物单体中。为此，设计一些基于二维纳米片层的杂化结构是拓宽二维材料应用的重要策略。
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TB383.1;TP212

【参考文献】