基于碳纳米材料和DNA放大技术的电化学传感器的构建及应用

发布时间：2020-08-16 21:58

【摘要】：电化学传感技术是通过检测电流、电位、电阻、电容等信号的变化来检测目标物质。电化学传感技术由于所需仪器简单、对目标检测物质选择性好、分析速度快、且检测成本低、易于微型化等优点,在生物医学、环境监测、食品检测、工业等领域具有广泛的应用前景。如何利用电化学传感技术快速、高灵敏检测,是当前的热门研究课题之一。近年来,碳纳米材料的运用为解决这些问题提供了新思路。碳纳米材料有:富勒烯、碳纳米管、石墨烯、碳点等,碳纳米材料不仅能够稳定存在,而且具有导电性好,电子传输速度快、比表面积大、反应活性高、生物相容性好等特点,因此在电化学领域得到了广泛的关注。核酸适配体(aptamer)是经由体外指数性富集配件系统进化技术筛选后得到的寡核苷酸序列片段(DNA或RNA),能与相应目标物特异性紧密结合。核酸适配体具有可体外合成,周期短,高特异性、高亲和力、稳定性好等优点。生物放大技术由于具有稳定性好、灵敏度高、生物兼容性和特异性高等优点而被广泛应用于电分析化学中。一些生物放大技术如:酶催化放大、目标循环放大、DNA扩增技术等广泛用于电化学生物传感器的构建中。因此,本论文基于碳纳米材料、核酸适配体和DNA放大技术,开展了以下工作:1.构建了一个新型的用碳点作为信号放大,硫堇(thionine,THi)作为信号探针的适配体的铅离子电化学传感器。首先巯基修饰的适配体通过金硫键的相互作用修饰到电极上,碳点通过π-π堆积相互作用进一步修饰到电极上,电化学探针进一步通过π-π堆积修饰到电极,在铅离子存在的时候,适配体与铅离子特异性结合,由单链转变为G4链体,导致碳点和硫堇离开电极表面,电化学信号减小,达到了检测铅离子的目的。在最优条件下检测的线性范围为:0.01-10 nM,检出限:3.8 pM。该传感器能够对水样中的铅离子进行了加入回收实验回收率:95.0%-104.3%。2.构建了基于氨基化氧化还原石墨烯(NH_2-rGO)对人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)基因的电化学检测,在玻碳电极上修饰NH_2-rGO后利用π-π堆积将捕获DNA(capture DNA)修饰到电极上,利用亚甲基蓝(Methylene blue,MB)能与DNA分子中的G碱基特异性结合将MB修饰到电极上,在HIV基因存在时,HIV能与capture DNA碱基互补配对形成双链DNA,由于NH_2-rGO对单链DNA的吸附强于双链DNA,造成双链DNA脱离电极表面,电流信号减小,达到检测的目的,在最优条件下检测的线性范围为:0.05-1pM,检出限:33 fM。该传感器能够实现对血样HIV进行了加入回收实验回收率:96.0%-106.6%。该传感器具有较高的选择性与灵敏性、较低的检出限和较宽的线性范围、抗干扰能力强,实现实际样品的检测等优点。3.构建了基于三螺旋结构的比率型的电化学传感器用于检测三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)。首先亚甲基蓝修饰的DNA(MB-DNA)通过金硫键修饰到金电极表面,6-巯基-1-己醇(6-mercaptohexanol,MCH)封闭电极的非特异性位点,通过Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对原则将二茂铁修饰的DNA(Fc-DNA)修饰到电极上形成三螺旋结构,此时,Fc靠近电极表面,电流信号最大,MB远离电极表面,电流信号最小,加入目标检测物ATP后,ATP与Fc-DNA特异性结合离开电极表面,Fc信号减小,三螺旋结构裂解,MB-DNA重新形成发卡结构,MB信号增大形成比率信号用于ATP的检测。检测范围:0.05-100 pM,检出限:5.2 fM。具有较高的选择性与灵敏性、较低的检出限和较宽的线性范围、抗干扰能力强,实现实际样品的检测等优点。4.构建了基于目标循环放大和滚环扩增放大(Rolling circle amplification,RCA)用于K-ras基因的检测。首先Fc修饰的发卡DNA(Fc-DNA)修饰到电极上,K-ras存在时打开发卡架构,核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ,Exo Ⅲ)能够将Fc-DNA剪切,Fc被剪切离开电极表面,信号减小;K-ras释放循环,经过酶剪切后剩余的Fc-DNA的单链DNA做RCA的引物DNA(primer DNA)进行RCA反应产生大量的富含G碱基的DNA,氯化血红素(hemin)能够与富含G碱基的DNA结合形成G-quadruplex/hemin复合物,作为电化学信号输出。在一定范围内,K-ras浓度越大,Fc越小,G-quadruplex/hemin信号越大,形成一个比率型电化学传感器。检测范围:0.5-10000 fM,检出限:0.286 fM。
【学位授予单位】：南宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.1;TP212.2
【图文】：

示意图,步骤,示意图,置换反应

图 1.1 HCR 的步骤示意图[34]A 链置换反应链置换反应（Strand displacement reaction， SDR）是一条ld 结合区域引发分支迁移将双链 DNA 中的一条单链置换出技术[34]。链置换反应可以进行是因为完全互补的双链之间的完全互补的双链。王思齐[35]等人构建了基于 DNA 链置换反化学传感器，其构建过程如下：首先将一条 5 端修饰巯基的键固定到金电极上，修饰有电化学指示剂 MB 的信号探针通部分杂交的 DNA 双链探针，暴露出未杂交的 toehold 结构存在时，基于本身的高选择性和反应动力学特点，目标DNA链结合，DNA 链置换反应开始，将信号链释放出来，造成检测的目的，实现了寡核苷酸多态性的检测，有效消除了外

示意图,示意图,置换反应,双链

图 1.1 HCR 的步骤示意图[34]链置换反应置换反应（Strand displacement reaction， SDR）结合区域引发分支迁移将双链 DNA 中的一条单链术[34]。链置换反应可以进行是因为完全互补的双链全互补的双链。王思齐[35]等人构建了基于 DNA 链学传感器，其构建过程如下：首先将一条 5 端修饰固定到金电极上，修饰有电化学指示剂 MB 的信号分杂交的 DNA 双链探针，暴露出未杂交的 toeh在时，基于本身的高选择性和反应动力学特点，目结合，DNA 链置换反应开始，将信号链释放出来测的目的，实现了寡核苷酸多态性的检测，有效消

示意图,辅助循环,靶标,示意图

促使 RCA 的发生，产生很有大量重复的长 DNA 单链结合形成 G-quadruplex/hemin 复合物作为电化学信号输出，在一定范度越大，形成的 G-quadruplex/hemin 越多，信号越大，两者呈现系，从而达到检测的目的，检出限为 0.25 fM。酶辅助的 DNA 循环放大辅助DNA循环是通过酶的剪切或聚合释放靶标DNA或与靶标DN，以参与下一轮杂交和释放，使得单个靶标或与靶标相关的物质多次信号放大[38]。袁若课题组[39]通过核酸内切酶辅助目标循环实现了。首先，在玻碳电极上修饰发卡探针 1（HP1），发夹探针 2（HP2形成适体-靶标复合物，HP2部分HP1杂交形成双链结构形成具有N性识别位点，Nt.BbvC I 酶进行剪切，双链结构裂解，释放靶标进。剪切后剩余的 HP1 作为的 RCA 引物，触发 RCA 反应产生大量长嵌入 hemin 形成 G-quadruplex/hemin 复合物，可以提高鲁米诺- H2OL 效率对共反应物 H2O2的催化性能，放大检测信号，达到高灵敏

【参考文献】