功能核酸用于环境及活细胞内金属离子的传感与成像研究

发布时间：2017-03-31 14:02

  本文关键词：功能核酸用于环境及活细胞内金属离子的传感与成像研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：金属元素在整个生命体系中有双重作用,一方面能维持动植物的生命活动,另一方面也可能危害其健康。因此,研究环境中及生物体内的金属离子含量与分布,并对其进行有效地检测,对于保护环境与人类健康有积极意义。功能核酸是指具有特定生物功能,一般指能高特异性结合特定目标物或具有某些催化功能的核酸分子。功能核酸探针在传感方面具有一些独特的优势：功能核酸可以通过指数富集配体系统进化法(SELEX)筛选获得,理论上任何目标物均可筛到其对应的功能核酸；已经筛到的功能核酸可以通过合成获得,适用于大批量生产；一些功能核酸,如左旋核酸(L-DNA)在生理环境下更稳定,抗酶切降解效果更好,为活体金属离子检测提供了可行性；最后,功能核酸可以经历多次变性复性而不改变其活性,更易保存,减少了设备消耗。更重要的是,一些功能核酸对金属离子表现出高度特异性,且响应信号与金属离子含量相关,这为简单、方便、有效地检测金属离子提供了可能性。因此,利用功能核酸的优点,我们设计了一系列的生物传感器用于检测环境和生物体内金属离子。在第二章中,我们构建了一种基于钾离子传感寡核苷酸(Potassium Sensing Oligonucleotide,简称PSO)的生物传感器。首先用修饰有荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,简称FRET)报告基团对的DNA链来优化PSO的终端,以获取更高的灵敏度,然后用DNA合成仪将二酰基脂质组装到PSO链上。在有钾离子出现时,形成的G-四聚体构型会使产生FRET效应的两种荧光基团(FAM和TAMRA)对靠近,从而导致FRET效率发生改变。此外,随着K+浓度的变化,荧光强度比率也是可逆的。基于这个实验方案,我们在细胞膜上组装了该传感器,并第一次将其用于实时检测细胞微环境中K+浓度的动态变化。在第三章中,我们构造了一种在均相溶液和活性细胞中的L型凝血酶结合适配体(L-type Thrombin Binding Aptame,简称L-TBA)K+传感器,通过用可预测的L-TBA的优点,演示基于L-TBA的K+传感器克服了天然D-PSO的缺陷,从而在活性细胞内实现K+成像并且表现出精确,安全和生物正交PSO的优点。在第四章中,我们基于Pb2+ DNAzymes,采用已报到的D-DNAzyme序列,根据L-DNAzyme与D-DNAzyme在存在非手性金属离子辅因子时有类似的催化活性,但在生物样品中,L-DNAzyme还有额外的生物稳定性的优点,设计了L-DNAzyme识别单元的生物传感器并将其用在环境水体检测,如湘江水,和复杂生物环境中,如胎牛血清(Fetal bovine serum,简称FBS),来检测Pb2+。目前,已筛选出的特异性识别各种离子的DNAzymes,很可能为针对灵敏性和选择性而发展的检测各种目标物的新的基于L-DNAzyme的传感系统在生物医学和环境检测领域提供更深一步的应用。
【关键词】：金属离子检测 功能核酸 G-四聚体 L-DNA L-DNAzyme
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TP212.3
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第1章 绪论11-22
• 1.1 金属离子在生物体内的作用11-12
• 1.2 目前检测金属离子的方法12-13
• 1.3 功能核酸在检测金属离子中的应用13-20
• 1.3.1 功能核酸13-14
• 1.3.2 功能核酸种类14-17
• 1.3.3 基于功能核酸的金属离子传感器17-20
• 1.4 本论文的研究工作20-22
• 第2章 固定在细胞膜上动态检测细胞微环境中钾离子的生物传感器22-32
• 2.1 引言22-23
• 2.2 实验部分23-25
• 2.2.1 试剂与仪器23-24
• 2.2.2 DNA合成24
• 2.2.3 荧光检测24-25
• 2.2.4 细胞培养25
• 2.2.5 流式分析25
• 2.2.6 共聚焦成像25
• 2.3 结果与讨论25-31
• 2.3.1 实验条件优化25-27
• 2.3.2 圆二色谱表征分析27-28
• 2.3.3 荧光检测28-29
• 2.3.4 流式分析与共聚焦29-31
• 2.4 小结31-32
• 第3章 生物稳定性的的L型G-四聚体用于细胞内钾离子传感32-44
• 3.1 前言32-34
• 3.2 实验部分34-37
• 3.2.1 材料和试剂34
• 3.2.2 DNA合成34-36
• 3.2.3 荧光检测36
• 3.2.4 凝胶电泳36
• 3.2.5 细胞培养36
• 3.2.6 共聚焦成像36-37
• 3.2.7 流式分析37
• 3.2.8 细胞毒性研究37
• 3.3 结果与讨论37-43
• 3.3.1 圆二色谱表征分析37-38
• 3.3.2 L-TBA探针在溶液中对K~+的检测分析38-39
• 3.3.3 L-TBA的稳定性分析39-41
• 3.3.4 L-TBA的毒性分析41-42
• 3.3.5 L-TBA对细胞内K~+成像分析42-43
• 3.4 小结43-44
• 第4章 生物稳定性的L-DNAzyme用于复杂实际样品中铅离子的检测44-55
• 4.1 引言44-45
• 4.2 实验部分45-47
• 4.2.1 试剂与仪器45-46
• 4.2.2 DNA合成46
• 4.2.3 荧光检测46
• 4.2.4 凝胶电泳46-47
• 4.3 结果与讨论47-54
• 4.3.1 实验原理47-48
• 4.3.2 圆二色谱表征及对映体酶链的热动力学研究48
• 4.3.3 对映体酶的催化活性48-51
• 4.3.4 对映体酶的生物稳定性51-52
• 4.3.5 L-DNAzymes在实际样品中的性能52-54
• 4.4 小结54-55
• 结论55-57
• 参考文献57-72
• 附录A 攻读学位期间发表的学术论文目录72-73
• 致谢73

  本文关键词：功能核酸用于环境及活细胞内金属离子的传感与成像研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：279676