基于适配体以及核酸自组装结构的ATP检测方法研究
发布时间：2022-01-12 06:12
ATP作为一种高能磷酸化合物广泛存在于各种生物体内,参与各项重要的生理生化活动。实现对于ATP的检测将会对我们研究各项生命活动提供极大的帮助。目前针对ATP的检测方法已经开展了很多研究,对于检测传感器的灵敏度,检测的速度等各方面也提出了越来越高的要求。本论文基于核酸自组装结构,构建了利用电化学以及适配体进行ATP高灵敏快速检测的生物传感器。本实验是利用当ATP存在时,四面体结构会对其产生响应从而发生构型变化形成G-四链体,通过电化学平台将这种变化转化为电信号实现对ATP的高灵敏检测。首先利用四条经过设计的序列进行四面体结构的合成,其中两条序列一条设计有ATP适配体,另一条设计有用于信号产生的G-四链体的两部分序列。然后将电极与靶标分子ATP以及血红素在一起孵育反应。当ATP存在时,一方面适配体与ATP结合从而使适配体发生形变,从而缩短四面体两个端点的距离。另一方面设计有G-四链体部分序列的两端由于距离缩小从而形成G-四链体,由于血红素进入形成复合物从而引起电极表面的电阻发生变化。通过差分脉冲伏安法（DPV）可以观察到有明显的信号变化。而当靶标ATP不存在时,由于G-四链体的两部分序列距...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：36 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
核酸自组装原理图
第三章结果与讨论15第三章结果与讨论3.1实验原理基于碱基互补配对和四面体结构变化来检测ATP的电化学传感器的原理如图3-1所示，首先合成了四条经过精心设计的序列。在S1，S2，S3的5’端设计有巯基，每条序列将设计有3个主要部分与其余的三条链作用。适配体处于S3序列中部，G-四链体的两部分处于S4的两端。4条序列的颜色相同部分将会在95℃高温变性和快速冷却到4℃后通过碱基互补配对组合在一起构成四面体的5条边来用于稳定四面体的结构。在剩余的一条边上设计有与ATP组合的适配体。在S3上适配体两端和S4上的有两段用于保证结构变化的两段浅绿色序列，在适配体与ATP结合时将会有助于G-四链体的两部分结合。在S4的两端设计G-四链体的12个G，按照9:3的比例分布在5’端和3’端。在经过高温变性和快速降温之后，修饰有巯基的3个末端将会出现在四面体的3个角，帮助四面体固定在电极的表面，另外一个角与底边上一个角为G-四链体的两部分，在它们中间设计有ATP适配体。当ATP不存在，适配体序列处于松弛状态，G-四链体的两部分距离较远不会相互结合，通过DPV检测可以发现信号基本不存在。而当ATP存在时，ATP会与适配体相结合，从而引起结构变化，使松弛的适配体变成紧张结构，将G-四链体的两部分拉近从而形成G-四链体。与此同时，加入的血红素将会进入G-四链体形成复合物从而造成电极表面的电阻增大。通过DPV检测即可发现电流的明显变化。图3-1ATP检测的电化学传感器原理Fig.3-1PrincipleofanelectrochemicalsensorforthedetectionofATP3.2实验原理的验证为了验证四面体结构的形成，在溶液中进行了四面体与血红素的结合试验，在四面
江南大学硕士学位论文16体结构形成之后，当溶液中存在ATP时，G-四链体会形成，血红素会进入其中形成复合物，从而催化H2O2对ABTS的氧化产生绿色复合物。而当ATP不存在时，G-四链体就不会形成，相应的就不会产生绿色的复合物。实验结果如图3-2所示，对照组中的颜色要明显比实验组中的颜色要淡，由此可见四面体在实验组中大量形成。比色实验结果见表3-1，发现空白的吸光值为0.255，实验组的吸光值平均值为0.733。对照组的吸光值要明显低于实验组。这就说明四面体结构在ATP的作用下大量形成。而在对照中仍有淡绿色，推测为当ATP不存在时，首先仍会有少量的同一个四面体上的G-四链体会形成或者不同的四面体间的G-四链体两部分发生作用形成结构，其次还有可能为未参与形成四面体的冗余序列上的G-四链体两部分通过组合形成了G-四链体。图3-2四面体的定性试验Fig.3-2Qualitativetestoftetrahedron对照：不加入ATP；实验组1，实验组2和实验组3分别加入ATP100nmolL-1表3-1四面体加入ATP后的吸光值Table3-1TheabsorptionvalueofatetrahedronafteraddingATP对照123平均值吸光值（425nm）0.2550.6920.7460.7610.733进一步验证四面体结构是否形成，所以采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来表征序列的逐步结合。随着序列的逐步结合，分子量会逐渐增大，所以在电泳图上就会表现为阶梯状的结果。如图3-3所示，泳道M为marker。泳道1为序列S1。泳道2在泳道1只有S1的基础上添加S2，S1和S2通过碱基互补配对结合在一起，分子量增加，所处条带要高于只有单独S1存在时的条带。同理，泳道3和泳道4的条带也随着序列的逐步加入逐步升高。通过电泳的结果就可以看出序列结合成功。当然除了高亮的区域之外还存在部分拖带的情况，这就可能为未参与形成G-四链体的冗余序?
【参考文献】：
期刊论文
[1]三磷酸腺苷对人胃癌细胞恶性表型的去恶化作用[J]. 郝纯毅,吕桂芝,蔡险峰,林仲翔. 中华肿瘤杂志. 1999(03)
本文编号：3584256
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：36 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
核酸自组装原理图
第三章结果与讨论15第三章结果与讨论3.1实验原理基于碱基互补配对和四面体结构变化来检测ATP的电化学传感器的原理如图3-1所示，首先合成了四条经过精心设计的序列。在S1，S2，S3的5’端设计有巯基，每条序列将设计有3个主要部分与其余的三条链作用。适配体处于S3序列中部，G-四链体的两部分处于S4的两端。4条序列的颜色相同部分将会在95℃高温变性和快速冷却到4℃后通过碱基互补配对组合在一起构成四面体的5条边来用于稳定四面体的结构。在剩余的一条边上设计有与ATP组合的适配体。在S3上适配体两端和S4上的有两段用于保证结构变化的两段浅绿色序列，在适配体与ATP结合时将会有助于G-四链体的两部分结合。在S4的两端设计G-四链体的12个G，按照9:3的比例分布在5’端和3’端。在经过高温变性和快速降温之后，修饰有巯基的3个末端将会出现在四面体的3个角，帮助四面体固定在电极的表面，另外一个角与底边上一个角为G-四链体的两部分，在它们中间设计有ATP适配体。当ATP不存在，适配体序列处于松弛状态，G-四链体的两部分距离较远不会相互结合，通过DPV检测可以发现信号基本不存在。而当ATP存在时，ATP会与适配体相结合，从而引起结构变化，使松弛的适配体变成紧张结构，将G-四链体的两部分拉近从而形成G-四链体。与此同时，加入的血红素将会进入G-四链体形成复合物从而造成电极表面的电阻增大。通过DPV检测即可发现电流的明显变化。图3-1ATP检测的电化学传感器原理Fig.3-1PrincipleofanelectrochemicalsensorforthedetectionofATP3.2实验原理的验证为了验证四面体结构的形成，在溶液中进行了四面体与血红素的结合试验，在四面
江南大学硕士学位论文16体结构形成之后，当溶液中存在ATP时，G-四链体会形成，血红素会进入其中形成复合物，从而催化H2O2对ABTS的氧化产生绿色复合物。而当ATP不存在时，G-四链体就不会形成，相应的就不会产生绿色的复合物。实验结果如图3-2所示，对照组中的颜色要明显比实验组中的颜色要淡，由此可见四面体在实验组中大量形成。比色实验结果见表3-1，发现空白的吸光值为0.255，实验组的吸光值平均值为0.733。对照组的吸光值要明显低于实验组。这就说明四面体结构在ATP的作用下大量形成。而在对照中仍有淡绿色，推测为当ATP不存在时，首先仍会有少量的同一个四面体上的G-四链体会形成或者不同的四面体间的G-四链体两部分发生作用形成结构，其次还有可能为未参与形成四面体的冗余序列上的G-四链体两部分通过组合形成了G-四链体。图3-2四面体的定性试验Fig.3-2Qualitativetestoftetrahedron对照：不加入ATP；实验组1，实验组2和实验组3分别加入ATP100nmolL-1表3-1四面体加入ATP后的吸光值Table3-1TheabsorptionvalueofatetrahedronafteraddingATP对照123平均值吸光值（425nm）0.2550.6920.7460.7610.733进一步验证四面体结构是否形成，所以采用了聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）来表征序列的逐步结合。随着序列的逐步结合，分子量会逐渐增大，所以在电泳图上就会表现为阶梯状的结果。如图3-3所示，泳道M为marker。泳道1为序列S1。泳道2在泳道1只有S1的基础上添加S2，S1和S2通过碱基互补配对结合在一起，分子量增加，所处条带要高于只有单独S1存在时的条带。同理，泳道3和泳道4的条带也随着序列的逐步加入逐步升高。通过电泳的结果就可以看出序列结合成功。当然除了高亮的区域之外还存在部分拖带的情况，这就可能为未参与形成G-四链体的冗余序?
【参考文献】：
期刊论文
[1]三磷酸腺苷对人胃癌细胞恶性表型的去恶化作用[J]. 郝纯毅,吕桂芝,蔡险峰,林仲翔. 中华肿瘤杂志. 1999(03)
本文编号：3584256
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