纳米孔单分子传感器的研制及初步评价
发布时间：2022-08-12 08:43
纳米孔传感器作为一种廉价、无需标记、高灵敏度且通量较高的单分子传感系统,近二十年来已经受到越来越多的关注。目前,使用最多的仍然是生物纳米孔,由于其较好的可重复性和稳定性,以及较高的检测精度,生物纳米孔被广泛地应用在各种有机无机分析物的检测和分析中,以及它们之间单分子水平的反应机制研究中。最常用做生物纳米孔的有α-溶血素（α-hemolysin）蛋白和耻垢分枝杆菌孔蛋白（Msp A）,但它们的野生型蛋白用于纳米孔分析时往往会存在自发阻塞和过孔速率较快等缺陷,必须经过蛋白质工程的相应突变改造后才可以达到特异性识别目标分析物以及降低过孔速率提高检测精度等目的。本课题为了着眼于更高精度纳米孔系统构建的探索,首先摸索了集成孔内纳米电极的固态纳米孔的制备方法和工艺参数,然后选择了常用的α-溶血素构建了生物纳米孔单分子检测系统,并对其稳定性影响因素进行了研究。另外,利用α-溶血素纳米孔研究了部分双链结构（duplex）DNA的解链过程,实现了对单链DNA分子间单个碱基差异性的区分。然后,使用蛋白质工程相关技术对野生型Msp A蛋白进行相应改造,并将新型的突变Msp A蛋白（Mut-Msp A）应用于...
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 纳米孔技术简介
1.3 纳米孔分类
1.3.1 生物纳米孔
1.3.2 固态纳米孔
1.3.3 复合纳米孔
1.4 不同生物纳米孔的比较
1.5 生物纳米孔在DNA单分子传感上的研究进展
1.5.1 α-溶血素(α-HL)孔蛋白用于DNA单分子检测
1.5.2 耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)用于DNA单分子检测
1.6 本课题选题构思及研究意义
1.6.1 研究目标
1.6.2 研究内容
1.6.3 研究方法和技术路线
第二章 孔内集成纳米电极的纳米孔制备
2.1 引言
2.2 实验材料和方法
2.2.1 材料
2.2.2 制作金线纳米电极
2.2.3 刻蚀出纳米电极
2.2.4 纳米电极封装
2.2.5 制作纳米孔
2.3 结果与讨论
2.3.1 金线完整度检测
2.3.2 制作纳米电极
2.3.3 制作纳米孔
2.4 本章小结
第三章 生物纳米孔单分子检测系统的构建
3.1 引言
3.2 实验材料和装置
3.2.1 磷脂双分子层膜制备
3.2.2 电学仪器
3.2.3 流体池
3.2.4 法拉第笼
3.2.5 制备Ag/AgCl电极
3.2.6 通道蛋白
3.3 实验部分
3.3.1 试剂和仪器
3.3.2 制备步骤
3.3.3 脂双层稳定性及质量评估
3.4 纳米孔单通道检测
3.4.1 纳米孔单通道制备
3.4.2 待测样品检测
3.5 数据采集和分析
3.5.1 数据数字化
3.5.2 采样和滤波
3.5.3 采集流程
3.5.4 信号分析
3.6 本章小结
第四章 α-溶血素孔对DNA分子间单碱基差异的区分
4.1 引言
4.2 实验部分
4.2.1 实验试剂
4.2.2 实验器材
4.2.3 实验步骤
4.3 结果与讨论
4.3.1 α-溶血素纳米孔单通道形成
4.3.2 原始信号分析
4.3.3 典型事件类型分析
4.3.4 基于解链行为差异的DNA单碱基差异区分
4.4 本章小结
第五章 新型MspA突变体蛋白表达和纯化及其对DNA均聚物的检测
5.1 引言
5.2 实验部分
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 结果与讨论
5.3.1 Mut-MspA的表达与纯化
5.3.2 Mut-MspA纳米孔通道形成能力
5.3.3 Poly(dT)100 易位通过Mut-MspA纳米孔
5.4 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
攻读博士学位期间发表论文目录
致谢
本文编号：3675565
【文章页数】：101 页
【学位级别】：博士
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中文摘要
英文摘要
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 纳米孔技术简介
1.3 纳米孔分类
1.3.1 生物纳米孔
1.3.2 固态纳米孔
1.3.3 复合纳米孔
1.4 不同生物纳米孔的比较
1.5 生物纳米孔在DNA单分子传感上的研究进展
1.5.1 α-溶血素(α-HL)孔蛋白用于DNA单分子检测
1.5.2 耻垢分枝杆菌孔蛋白A(MspA)用于DNA单分子检测
1.6 本课题选题构思及研究意义
1.6.1 研究目标
1.6.2 研究内容
1.6.3 研究方法和技术路线
第二章 孔内集成纳米电极的纳米孔制备
2.1 引言
2.2 实验材料和方法
2.2.1 材料
2.2.2 制作金线纳米电极
2.2.3 刻蚀出纳米电极
2.2.4 纳米电极封装
2.2.5 制作纳米孔
2.3 结果与讨论
2.3.1 金线完整度检测
2.3.2 制作纳米电极
2.3.3 制作纳米孔
2.4 本章小结
第三章 生物纳米孔单分子检测系统的构建
3.1 引言
3.2 实验材料和装置
3.2.1 磷脂双分子层膜制备
3.2.2 电学仪器
3.2.3 流体池
3.2.4 法拉第笼
3.2.5 制备Ag/AgCl电极
3.2.6 通道蛋白
3.3 实验部分
3.3.1 试剂和仪器
3.3.2 制备步骤
3.3.3 脂双层稳定性及质量评估
3.4 纳米孔单通道检测
3.4.1 纳米孔单通道制备
3.4.2 待测样品检测
3.5 数据采集和分析
3.5.1 数据数字化
3.5.2 采样和滤波
3.5.3 采集流程
3.5.4 信号分析
3.6 本章小结
第四章 α-溶血素孔对DNA分子间单碱基差异的区分
4.1 引言
4.2 实验部分
4.2.1 实验试剂
4.2.2 实验器材
4.2.3 实验步骤
4.3 结果与讨论
4.3.1 α-溶血素纳米孔单通道形成
4.3.2 原始信号分析
4.3.3 典型事件类型分析
4.3.4 基于解链行为差异的DNA单碱基差异区分
4.4 本章小结
第五章 新型MspA突变体蛋白表达和纯化及其对DNA均聚物的检测
5.1 引言
5.2 实验部分
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 结果与讨论
5.3.1 Mut-MspA的表达与纯化
5.3.2 Mut-MspA纳米孔通道形成能力
5.3.3 Poly(dT)100 易位通过Mut-MspA纳米孔
5.4 本章小结
第六章 总结与展望
6.1 总结
6.2 展望
参考文献
攻读博士学位期间发表论文目录
致谢
本文编号：3675565
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