基于多适配体和荧光共振能量转移技术的蛋白质检测方法研究

发布时间：2017-05-15 12:14

  本文关键词：基于多适配体和荧光共振能量转移技术的蛋白质检测方法研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：荧光共振能量转移(FRET)是距离足够近的两个荧光分子间产生的一种能量转移现象。当供体荧光分子的发射光谱与受体荧光分子的吸收光谱重叠,并且两个分子的距离在10nm范围之间时,就会发生一种无辐射途径的能量转移。同时供体分子荧光分子淬灭,受体荧光增强的现象。近几年,人们致力于这种新型技术的实践,广泛将其应用在生物传感器、生物分子检测、生物医药领域。氧化石墨烯(GO)一般作为能量受体可以高效地猝灭多种量子点(QDs)、有机染料的荧光。由于GO具有优异的电学性能,而被广泛应用到基于FRET原理的生物传感器中。值得关注的是,目前大多数基于GO的荧光共振能量转移的传感器均采用单一适配体进行目标蛋白的检测,基于目标物的多适配体GO-FRET技术实现目标检测尚未见报道。微流控芯片电泳具有上样量少,进样方式智能化,分离时间更短等优点。其中的二维分离系统比一维分离具有更高的峰容量,具有更大的研究潜力,而且芯片上的复杂微流路更容易实现二维或多维分离。因此,本论文基于FRET现象,采用多适配体构建了FRET传感器,并且结合微流控芯片电泳技术的高效分离能力进行了高灵敏度多目标检测研究。主要研究工作如下:(1)设计了一种基于氧化石墨烯-荧光共振能量转移的传感器。利用荧光基团标记的核酸多适配体作为荧光供体分子,氧化石墨烯(GO)作为荧光受体分子,首先荧光标记多适配体被氧化石墨烯吸附,适配体所标记荧光淬灭,当体系中加入的样品中含有多适配体的配体蛋白时,蛋白会与多适配体结合并诱导这条寡核苷酸发生构象变化,从而从GO上脱落,引起荧光的重新恢复。本论文通过对核酸多适配体浓度、GO浓度的优化,得到了GO-FRET传感器的适宜实验条件。比较适配体和多适配体的检出限,初步显示多适配体技术可以显著提高检测检出灵敏度。(2)建立氧化石墨烯-多适配体FRET传感器的方法实现了实际样品大鼠尿样中的溶菌酶的浓度测定。首先考察了在尿样中添加不同浓度溶菌酶,考察荧光恢复程度与溶菌酶浓度的线性关系,之后测定样品中溶菌酶浓度。实验表明该方法可以应用于实际样品中溶菌酶的测定。(3)将基于适配体的氧化石墨烯的FRET传感器技术应用于凋亡细胞释放细胞色素C的动态检测。采用了人神经母细胞瘤细胞,建立凋亡模型,以考察细胞凋亡过程中胞浆Cyt C变化情况。利用氧化石墨烯作为能量受体,含有荧光标记的核酸适配体作为供体研究细胞凋亡时线粒体对胞浆细胞色素C的动力学释放,并与经典的western blot方法进行比较。同时考察方法最低检出限以及定量回收率。(4)设计并建立了一种基于氧化石墨烯-多适配体荧光共振能量转移的微流控芯片电泳分离方法,实现了凝血酶、细胞色素C和溶菌酶三种蛋白质的高灵敏度并且同时检测。利用GO-多适配体的FRET现象使蛋白荧光恢复之后,采用第一维等点聚焦的微流控芯片电泳分离三种蛋白与各自适配体的复合物,实现三种目标蛋白质的同时检测。
【关键词】：荧光共振能量转移 核酸适配体 蛋白质检测 微流控芯片电泳
【学位授予单位】：北京理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;R446;TP212.3
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-21
• 1.1 荧光共振能量转移技术12
• 1.2 氧化石墨烯简要介绍12-15
• 1.3 基于石墨烯的荧光共振能量转移应用15-18
• 1.4 多适配体技术18-19
• 1.5 微流控芯片19-20
• 1.6 本论文的主要研究内容及意义20-21
• 第二章 基于氧化石墨烯-荧光共振能量转移的传感器的设计21-32
• 2.1 实验部分21-22
• 2.1.1 实验仪器与试剂21
• 2.1.2 试剂的配制21-22
• 2.1.3 目标蛋白的检测22
• 2.2 结果与讨论22-32
• 2.2.1 最大适配体浓度的确定22-23
• 2.2.2 最大石墨烯浓度的考察23-24
• 2.2.3 不同数量适配体最大适配体浓度的比较24-25
• 2.2.4 单适配体和多适配体恢复情况比较25-28
• 2.2.5 不同蛋白浓度对荧光恢复的影响28-32
• 第三章 建立氧化石墨烯-多适配体 FRET 传感器的方法实现了实际样品大鼠尿样中的溶菌酶的浓度测定32-35
• 3.1 引言32-33
• 3.2 实验部分33
• 3.2.1 实验仪器与试剂33
• 3.2.2 尿样中溶菌酶的检测33
• 3.3 结果与讨论33-35
• 3.3.1 尿样中溶菌酶的检测33-35
• 第四章 基于适配体的氧化石墨烯的 FRET 传感器技术应用于凋亡细胞释放细胞色素 C 的动态检测35-46
• 4.1 引言35-37
• 4.2 实验部分37-42
• 4.2.1 实验仪器与试剂37-39
• 4.2.2 试剂的配制39-40
• 4.2.3 SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞的培养40
• 4.2.4 确定给药浓度：MTT40-41
• 4.2.5 提取不含线粒体的胞浆蛋白41
• 4.2.6 目标蛋白对荧光的淬灭和恢复41
• 4.2.7 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度41-42
• 4.3 结果与讨论42-46
• 4.3.1 细胞凋亡给药浓度确定42-43
• 4.3.2 样品稀释倍数的确定43
• 4.3.3 样品稀释倍数的确定43-44
• 4.3.4 对不同给要浓度作用对凋亡细胞所释放对CYT C的检测44
• 4.3.5 与经典实验WESTERN BLOT的对比44-46
• 第五章 建立GO-多适配体FRET传感器的微流控芯片电泳分离蛋白46-52
• 5.1 实验部分46-50
• 5.1.0 实验仪器与试剂46
• 5.1.1 实验试剂46-47
• 5.1.2 芯片制作流程47-48
• 5.1.3 溶液配制48
• 5.1.4 芯片刻蚀流程48
• 5.1.5 芯片热键和48-49
• 5.1.6 双T通道结构49-50
• 5.1.7 蛋白等电聚焦分离50
• 5.2 结果与讨论50-52
• 5.2.1 芯片电泳结果50-52
• 结论52-53
• 参考文献53-58
• 攻读学位期间发表论文与研究成果清单58-59
• 致谢59

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