抗TNFα纳米抗体的改造及其在光纤SPR传感器特异性检测方面的应用

发布时间：2022-09-21 20:21

　　肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factorα,TNFα）是一种多功能细胞因子,由巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞和B细胞等多种细胞类型表达和分泌。它通过与细胞表面的受体TNFR1和TNFR2相互作用,发挥其正常的生理功能,如促炎症级联、凋亡、细胞增殖和免疫调节等。然而,在患有自身免疫性疾病的患者中,高水平的TNFα可导致不必要的炎症和细胞毒性,从而进一步导致疼痛症状。此外,TNFα和肥胖-糖尿病综合征、重度抑郁及动脉粥样硬化等疾病也有着密切的关系。因此,TNFα已日益成为十分重要的生物标志物及药物作用靶点。目前,应用单克隆抗体阻断TNFα与受体之间的相互作用已成为治疗TNFα相关疾病的主要手段,例如英夫利昔单抗、赛妥珠单抗和阿达木单抗等。与这些传统单克隆抗体相比,纳米抗体不仅保持了高亲和力和高特异性的特征,并具有体积小、热稳定性高、免疫原性低、化学操作性强和经济生产等方面的优势。前人通过噬菌体筛选技术获得了羊驼抗体衍生的纳米抗体VHH2,可以特异性识别TNFα并阻断TNFα与其受体TNFR1和TNFR2的结合。该研究显示VHH2在一定程度上具有作为药物和检测试剂的潜力。尽管... 

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 TNFα蛋白的概述
        1.1.1 TNFα的基因序列和蛋白结构
        1.1.2 TNFα的生物体内来源和分布
        1.1.3 TNFα的信号转导和生物学功能
            1.1.3.1 TNFR1依赖的信号通路
            1.1.3.2 TNFR2依赖的信号通路
        1.1.4 TNFα相关的疾病
            1.1.4.1 TNFα与糖尿病的关联
            1.1.4.2 TNFα与自免疫疾病的关联
            1.1.4.3 TNFα与肿瘤的关联
    1.2 TNFα的生物物理检测方法
    1.3 新型光纤表面等离子体共振传感器(FO-SPR)
    1.4 研究目的与意义
第2章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株及质粒
        2.1.2 主要实验试剂和耗材
        2.1.3 主要实验仪器
        2.1.4 实验室常用溶液配制
            2.1.4.1 蛋白表达所需溶液
            2.1.4.2 蛋白纯化所需溶液
            2.1.4.3 SDS-PAGE电泳缓冲液
            2.1.4.4 ELISA实验所需溶液
    2.2 实验方法
        2.2.1 重组质粒的构建
            2.2.1.1 p GEX4T-1-TNFα的构建
            2.2.1.2 纳米抗体p ET22b-VHH2/VHH2B/V2CC的构建
        2.2.2 重组质粒转化
        2.2.3 蛋白的诱导及表达
        2.2.4 蛋白的纯化
            2.2.4.1 TNFα的纯化
            2.2.4.2 纳米抗体的纯化
        2.2.5 Bradford法测定蛋白质浓度
        2.2.6 ELISA实验测定TNFα与纳米抗体VHH2、VHH2B及 V2CC的亲和力
        2.2.7 FO-SPR传感器的构造及传感系统
            2.2.7.1 FO-SPR传感器的构造
            2.2.7.2 FO-SPR传感器的传感系统
        2.2.8 FO-SPR传感器的生物修饰及检测过程
            2.2.8.1 修饰前传感器的筛选
            2.2.8.2 纳米抗体的定向固定
            2.2.8.3 传感器的生物修饰过程
            2.2.8.4 传感器的检测过程
第3章 结果
    3.1 TNFα的实验结果
        3.1.1 TNFα的基因克隆序列结果
            3.1.1.1 TNFα蛋白序列
            3.1.1.2 密码子优化及DNA序列
            3.1.1.3 合成重组质粒的酶切验证
            3.1.1.4 合成重组质粒的测序验证
        3.1.2 TNFα的镍柱纯化
    3.2 纳米抗体VHH2、VHH2B及 V2CC的实验结果
        3.2.1 VHH2、VHH2B及 V2CC的蛋白序列设计及合成结果如下:
        3.2.2 VHH2、VHH2B及 V2CC的纯化
    3.3 ELISA验证TNFα与 VHH2、VHH2B和 V2CC的相互作用
    3.4 FO-SPR传感器的性能检测
    3.5 纳米抗体VHH2 修饰FO-SPR传感器的最佳浓度
    3.6 VHH2、VHH2B或 V2CC修饰的FO-SPR传感器对TNFα的亲和力比较
    3.7 VHH2 修饰的FO-SPR传感器特异性检测TNFα的能力
第4章 结论
参考文献
《指导教师对学位论文的学术评语》
《学位论文答辩委员会决议书》
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Molecular mechanism of action of anti-tumor necrosis factor antibodies in inflammatory bowel diseases[J]. Ulrike Billmeier,Walburga Dieterich,Markus F Neurath,Raja Atreya.  World Journal of Gastroenterology. 2016(42)



本文编号：3680601