类手枪脱氧核酶在糖传感器中的设计应用

发布时间：2017-08-11 00:27

  本文关键词：类手枪脱氧核酶在糖传感器中的设计应用

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【摘要】：上世纪80年代初,Cech和Altman等分别在内含子和RNase P中发现了具有催化功能的RNA分子,称为核酶(RNAzyme,ribozyme)。核酶的发现改变了“酶即蛋白质”这一传统学术观念,继而引发了对DNA催化功能的研究。1994年,Breaker和Joyce首次报道了一种Pb2+依赖且具有断裂RNA活性的DNA分子,其反应动力学遵循米氏方程,这类具有特异性催化功能DNA称之为脱氧核酶(DNAzyme,deoxyribozyme)。迄今为止,生物体内天然存在的脱氧核酶尚未被发现,所有催化类型脱氧核酶都是通过体外进化筛选获得,其中具有断裂活性脱氧核酶占多数,例如类手枪脱氧核酶(pistol-like DNAzyme,PLDz)。该脱氧核酶是Breaker实验室以“Cu2+/维生素C”为辅因子通过体外进化筛选获得的一种具有自身断裂活性的单链DNA分子,其催化机制被认为是自由基介导的DNA氧化断裂反应。在Breaker等人的研究基础上,我们对类手枪脱氧核酶的酶学性质、构效关系以及催化机制等方面进行了较为深入研究。本论文将重点介绍该脱氧核酶在葡萄糖和蔗糖传感器方面的应用研究。根据类手枪脱氧核酶催化活性与辅因子之间关系,我们设计了一种双酶偶联型葡萄糖传感器GOx-PLDz 1.0,其检测原理为:样品中β-D-葡萄糖作为一级信号分子被葡萄糖氧化酶识别并将其催化生成葡萄糖酸和H2O2,H2O2作为二级信号分子被类手枪脱氧核酶识别,在H2O2和二价金属离子存在下,该脱氧核酶发生自身断裂反应,断裂程度与溶液中葡萄糖浓度关系符合“Double Boltzmann”方程。GOx-PLDz 1.0传感器葡萄糖检测下限5μM,利用该传感器对泪液和唾液中葡萄糖含量进行了检测,其含量分别为720±81和405±56μM,实现了非创伤方式检测体内葡萄糖含量。在GOx-PLDz 1.0设计基础上,我们引入反式结构类手枪脱氧核酶构建GOx-PLDz 1.1,表明反式结构类手枪脱氧核酶可以作为新一代葡萄糖传感器元件。为提高葡萄糖传感器实用性和操作性,我们在GOx-PLDz 1.0和1.1基础上发展出一种高灵敏荧光型葡萄糖传感器GOx-PLDz 2.0。GOx-PLDz 2.0的检测原理与GOx-PLDz 1.0和1.1的检测原理相同,最大的区别之处在于信号输出部分,我们在类手枪脱氧核酶与底物化学修饰荧光/淬灭分子,当葡萄糖存在时,GOxPLDz 2.0发射荧光信号,可大幅提高传感器检测灵敏度。荧光信号强度与葡萄糖浓度之间关系符合“Extreme”方程,葡萄糖浓度检测下限为50 nM。利用GOxPLDz 2.0传感器,我们对10个唾液样品进行检测分析。在类手枪脱氧核酶构效关系研究中,我们发现了一个活性增强的突变体PLDz-T3G。我们将蔗糖酶、葡萄糖氧化酶以及类手枪脱氧核酶突变体(PLDz-T3G)组合,在葡萄糖传感器GOx-PLDz 1.0基础上设计了三酶偶联型蔗糖传感器IGP1.0,其蔗糖检测下限为5μM。葡萄糖氧化酶预处理后,IGP 1.0传感器表现出较强的抗干扰性。利用该传感器我们对8种饮料中蔗糖浓度进行检测,发现可口可乐零度含有痕量蔗糖,可口可乐、百事可乐以及红牛中蔗糖含量在配料表标注的范围内,而以绿茶为代表的茶饮料中则由于含有维生素C干扰蔗糖检测。基于类手枪脱氧核酶,我们成功设计了葡萄糖传感器GOx-PLDz 1.0、1.1和2.0以及蔗糖传感器IGP 1.0,这些传感器表明脱氧核酶在糖生物传感器中具有较广阔的应用前景。以此为基础,整合其他功能性材料,如金纳米颗粒、碳纳米管以及石墨烯等,未来可以研究开发出“超灵敏”、“可视化”葡萄糖和蔗糖传感器,前者服务于广大糖尿病患者及易感人群日常体内葡萄糖浓度检测,后者应用在生物体内蔗糖代谢研究。
【关键词】：类手枪脱氧核酶 葡萄糖氧化酶 蔗糖酶 葡萄糖传感器 蔗糖传感器
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TP212.3;Q55
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-24
• 1.1 葡萄糖传感器的研究进展11-14
• 1.1.1 电化学葡萄糖传感器11-12
• 1.1.2 化学发光型葡萄糖传感器12-13
• 1.1.3 比色型葡萄糖传感器13
• 1.1.4 荧光型葡萄糖传感器13-14
• 1.2 蔗糖传感器的研究进展14-15
• 1.3 脱氧核酶概述15-24
• 1.3.1 脱氧核酶与辅因子关系16-19
• 1.3.2 脱氧核酶在基因沉默方面的应用19
• 1.3.3 基于脱氧核酶设计构建DNA分子装置19
• 1.3.4 基于脱氧核酶设计构建传感器19-24
• 第2章 实验材料、设备及方法24-31
• 2.1 实验仪器24-25
• 2.2 试剂和溶液配制25-26
• 2.3 其他实验材料26-27
• 2.4 实验方法27-31
• 2.4.1 葡萄糖检测27
• 2.4.2 葡萄糖传感器拟合方程27-28
• 2.4.3 实际样品中的葡萄糖检测28-29
• 2.4.4 蔗糖检测29
• 2.4.5 蔗糖传感器拟合方程29-30
• 2.4.6 抗干扰样品处理30-31
• 第3章 基于类手枪脱氧核酶设计构建葡萄糖传感器31-52
• 3.1 葡萄糖传感器GOx-PLDz 1.0 研究31-42
• 3.1.1 葡萄糖传感器GOx-PLDz 1.0 设计与检测原理31-32
• 3.1.2 外加H2O2模拟测定葡萄糖32-34
• 3.1.3 金属离子对传感器GOx-PLDz 1.0 影响34-37
• 3.1.4 GOx-PLDz 1.0 传感器检测条件优化37-39
• 3.1.5 GOx-PLDz 1.0 传感器灵敏度和专一性鉴定39-40
• 3.1.6 测定泪液、唾液中葡萄糖含量40-42
• 3.2 葡萄糖传感器GOx-PLDz 1.1 研究42-43
• 3.3 葡萄糖传感器GOx-PLDz 2.0 研究43-48
• 3.3.1 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖传感器设计与检测原理43-44
• 3.3.2 荧光与淬灭分子选择44-45
• 3.3.3 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖传感器检测条件优化45-46
• 3.3.4 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖传感器灵敏度与专一性鉴定46-47
• 3.3.5 唾液样品检测47-48
• 3.4 葡萄糖传感器研究讨论48-50
• 3.4.1 GOx-PLDz 1.0 生物传感器研究意义48-49
• 3.4.2 荧光型葡萄糖传感器GOx-PLDz 2.049-50
• 3.4.3 GOx-PLDz 2.0 葡萄糖传感器改进与发展50
• 3.5 葡萄糖传感器研究结论50-52
• 第4章 基于类手枪脱氧核酶设计构建蔗糖传感器52-62
• 4.1 蔗糖传感器IGP 1.0 研究52-61
• 4.1.1 蔗糖传感器IGP 1.0 设计与检测原理52-53
• 4.1.2 类手枪脱氧核酶与突变体T3G活性比较53-54
• 4.1.3 蔗糖传感器IGP 1.0 检测条件优化54-56
• 4.1.4 蔗糖传感器IGP 1.0 灵敏度、专一性以及抗干扰性56-59
• 4.1.5 饮料样品检测59-61
• 4.2 蔗糖传感器IGP 1.0 研究讨论61
• 4.3 蔗糖传感器IGP 1.0 研究结论61-62
• 参考文献62-67
• 研究生期间发表的文章67-68
• 致谢68

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