基于滚环扩增和核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大的高灵敏荧光生物传感器研究

发布时间：2017-08-18 04:09

  本文关键词：基于滚环扩增和核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大的高灵敏荧光生物传感器研究

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【摘要】：滚环扩增(RCA)作为一种等温放大过程,有着极强的核酸扩增能力,不仅可直接对特定的DNA分子进行扩增,还能将靶核酸的信号进行放大,得到一条由环形DNA模板互补序列串联组成的长单链DNA。通过设计环形DNA模板的序列,可赋予RCA产物药物负载、靶标识别、荧光成像等功能。核酸外切酶Ⅲ因其高效的催化水解能力以及对3’端平齐或凹陷的双链DNA特异的识别能力被广泛应用到信号放大战略中。本研究论文将滚环扩增技术和核酸外切酶Ⅲ辅助循环放大技术与生物传感方法相结合,构建了一种多重信号放大的荧光生物传感平台,实现对核酸酶、micro RNA、小分子物质和离子的检测。(1)第二章,基于滚环扩增(RCA)和核酸外切酶Ⅲ (Exo Ⅲ)辅助循环放大,构建了一个稳健的传感平台用于S1核酸酶的高灵敏检测。将S1核酸酶的底物DNA链(sDNA)设计成引发RCA的引物DNA链,得到的RCA产物与大量TaqMan探针互补杂交形成TaqMan探针3’端凹陷的双链结构,在Exo Ⅲ的存在下,TaqMan探针从3’端开始被水解,其上的荧光基团被释放产生荧光信号。与此同时,3’端凸出的RCA产物则免遭酶切继续与其它TaqMan探针杂交,循环往复,产生显著增强的荧光信号。当体系中存在S1核酸酶时,sDNA被水解成单个或小片段的脱氧核糖核苷酸,此时缺乏引物DNA链,致使RCA反应和后续的Exo Ⅲ辅助循环放大反应无法进行,从而检测不到荧光信号,且荧光强度随S1核酸酶浓度的增加而降低。由于进行了双重信号放大,该方法展示了极其优异的灵敏性,对S1核酸酶的检测下限达到了5.0×10-7UμL-1。该传感器用于实际样品分析中也有令人满意的结果。(2)第三章,建立了一种利用滚环扩增(RCA)连接两次核酸外切酶Ⅲ (Exo Ⅲ)辅助循环放大(Exo Ⅲ-RCA-Exo Ⅲ)的荧光传感平台用于超灵敏地检测microRNA。设计的3’端凸出的发夹DNA集识别靶标和信号转导多种功能于一体,发夹DNA和目标micro RNA互补杂交后形成双链部分的序列将被Exo Ⅲ水解移除,从而释放出可继续打开其它发夹DNA的目标micro RNA和引发RCA反应的引物DNA链。该引物链可与RCA中的环形DNA模板杂交并延伸得到RCA产物,RCA产物上包含成千上万个可与TaqMan探针互补杂交的序列,杂交后形成TaqMan探针的3’端凹陷、RCA产物3’端凸出的单双链串联结构,在Exo Ⅲ的存在下,TaqMan探针被水解,荧光基团脱离淬灭基团,产生荧光信号。该方法的动态响应范围达到七个数量级,且检测限达到了0.32 aM。(3)第四章,基于滚环扩增(RCA)和核酸外切酶Ⅲ (Exo Ⅲ)辅助循环的双重放大荧光传感平台,利用一些物质(ATP、钾离子)对S1核酸酶活性的抑制作用实现了对ATP和K~+的检测。S1核酸酶是单链特异性核酸内切酶,因体系中存在S1核酸酶,单链的RCA引物链(t-DNA)被水解成单个或小片段的核苷酸,因此无法引发RCA反应,后续的Exo Ⅲ酶切反应也无法进行,致使荧光信号难以被检测。当反应体系中存在ATP或K~+时,t-DNA因S1核酸酶的水解活性被抑制而免遭水解,RCA反应和Exo Ⅲ辅助的荧光信号放大反应顺利进行,荧光大大增强。ATP和K~+的线性响应范围分别为5-200 nM和0.5-5 mM,检测下限分别为0.5 nM和2 nM。此外,该方法还可用于核酸酶抑制剂的筛选。
【关键词】：荧光生物传感器 滚环扩增 核酸外切酶Ⅲ S1核酸酶 Micro RNA 三磷酸腺苷
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：O657.3;TP212.3
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-25
• 1.1 荧光生物传感器11-16
• 1.1.1 荧光产生的原理12
• 1.1.2 荧光生物传感器的分类12-15
• 1.1.3 荧光生物传感器的应用15-16
• 1.2 滚环扩增技术16-20
• 1.2.1 滚环扩增的原理16-17
• 1.2.2 滚环扩增的分类17-18
• 1.2.3 滚环扩增的发展与应用18-20
• 1.3 基于核酸切割酶的信号放大技术在生物传感中的应用20-23
• 1.3.1 基于核酸内切酶的信号放大技术20-21
• 1.3.2 基于核酸外切酶的信号放大技术21-23
• 1.4 本论文构思23-25
• 第2章 基于滚环扩增和核酸外切酶Ⅲ辅助循环的双重放大荧光传感器用于S1核酸酶的高灵敏检测25-37
• 2.1 前言25-26
• 2.2 实验部分26-27
• 2.2.1 试剂和仪器26
• 2.2.2 环形探针的制备26-27
• 2.2.3 S1核酸酶的检测27
• 2.2.4 滚环扩增反应27
• 2.2.5 核酸外切酶Ⅲ辅助的循环放大27
• 2.3 结果与讨论27-36
• 2.3.1 实验原理27-28
• 2.3.2 传感器的验证28-29
• 2.3.3 实验条件优化29-33
• 2.3.4 S1核酸酶的检测分析33-35
• 2.3.5 选择性考察35
• 2.3.6 实际样品分析35-36
• 2.4 小结36-37
• 第3章 基于滚环扩增桥连的两次核酸外切酶Ⅲ辅助循环的多重放大荧光传感器用于micro RNA的超灵敏检测37-46
• 3.1 前言37-38
• 3.2 实验部分38-40
• 3.2.1 试剂和仪器38-39
• 3.2.2 环形探针的制备39
• 3.2.3 核酸外切酶Ⅲ辅助的目标micro RNA循环放大39
• 3.2.4 滚环扩增反应39-40
• 3.2.5 核酸外切酶Ⅲ辅助的荧光信号放大40
• 3.3 结果与讨论40-45
• 3.3.1 实验原理40-41
• 3.3.2 传感器的验证41-42
• 3.3.3 实验条件的优化42-44
• 3.3.4 micro RNA的检测分析44
• 3.3.5 选择性考察44-45
• 3.4 小结45-46
• 第4章 基于滚环扩增和核酸外切酶Ⅲ辅助循环的双重放大荧光传感器用于ATP和K~+的检测46-54
• 4.1 前言46-47
• 4.2 实验部分47-48
• 4.2.1 试剂和仪器47-48
• 4.2.2 环形探针的制备48
• 4.2.3 ATP和K~+的检测48
• 4.2.4 滚环扩增反应48
• 4.2.5 核酸外切酶Ⅲ辅助的循环放大48
• 4.3 结果与讨论48-53
• 4.3.1 检测原理48-49
• 4.3.2 传感器的验证49-50
• 4.3.3 实验条件的优化50-51
• 4.3.4 ATP和K~+的检测分析51-52
• 4.3.5 选择性考察52-53
• 4.4 小结53-54
• 结论54-55
• 参考文献55-69
• 附录A 攻读学位期间发表的学术论文69-70
• 致谢70

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本文编号：692589