曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系的建立

发布时间：2017-11-10 03:12

  本文关键词：曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系的建立

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【摘要】：目的:旨在建立曲霉菌属实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)检测体系,以实现快速、准确、特异地检测临床侵袭性真菌感染中常见的曲霉菌属病原菌,主要包括烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌,为曲霉菌属PCR检测试剂盒的开发提供实验基础。方法:于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)购买真菌标准株,经适合条件培养后制成200mg左右的真菌固体组织标本及浓度约为105个孢子/mL的孢子混悬液标本,分别用液氮研磨法、一步裂解加热法两种方法提取两种标本DNA,存在冰箱备用。在基因库(NCBI)中分别下载多种真菌、细菌、病毒以及人类基因序列,通过比对找出四种曲霉菌:烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌、土曲霉菌各自的特异性区域,利用Primer Premier 5.0和Beacon Designer 7.7设计引物探针,并通过FQ-PCR检测筛选最佳引物探针,通过对比液氮研磨法、一步裂解加热法方法提取曲霉菌DNA的效率及扩增效果,寻找适合FQ-PCR检测的曲霉菌DNA提取的方法,验证反应体系的特异性、重复性,并分析各自反应的灵敏度,建立出特异性、重复性好、灵敏度高的检测体系。结果:曲霉菌以三点三角式接种于SDA培养基,在37°C培养箱中生长3-4天,生长良好,能观察到不同菌落形态。用液氮研磨法与一步结合加热法提取曲霉菌的DNA并进行荧光定量PCR对比曲线,结果提示液氮研磨法与一步结合加热法提取的DNA行的荧光定量PCR皆为典型“S”型,以两样本t检验比较不同提取方法的Ct值,P0.05,无统计学意义。下载筛选出最佳引物探针,以此引物探针在相同条件、对同类型样本行荧光定量PCR,曲线均呈典型“S”型,并对建成的反应体系进行特异性检测,未见特异性扩增,批内、批间重复性实验的Ct值变异系数,结果均小于5%(在0.37%至3.53%之间),四种曲霉菌的灵敏度均至少可达到约35个孢子/mL。结论:1.对于真菌固体组织标本,液氮研磨法提取DNA浓度、纯度高,对于曲霉菌标准株培养的孢子冲洗标本,一步结合加热法提取曲霉菌DNA操作简单、能有效的运用于实时荧光定量PCR检测。2.成功设计筛选出烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌的引物探针,建立了曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系,其检测体系特异性高、灵敏性及重复性好。
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R440

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本文编号：1164813