人丙氨酸氨基转移酶同工酶1单克隆抗体的筛选鉴定及胶体金快速检测试纸条的制备

发布时间：2017-12-04 07:03

  本文关键词：人丙氨酸氨基转移酶同工酶1单克隆抗体的筛选鉴定及胶体金快速检测试纸条的制备

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【摘要】：目的:丙氨酸氨基转移酶(ALT)被广泛认为是肝损伤和临床前药物毒性研究最敏感的标志物,临床主要通过测定其总活性来判断是否有肝损伤。对ALT的两种同工酶,ALT1和ALT2的特异性检测较ALT总活性测定具有更高的诊断价值。本研究主要通过基因重组技术获得ALT1同工酶重组蛋白,并采用杂交瘤细胞技术制备出具有高度特异性和灵敏度的ALT1同工酶单抗,然后通过抗体的配对筛选获得能够特异性检测ALT1的最佳配对单克隆抗体。以筛选出的单抗为基础,制备出ALT1胶体金免疫层析试纸条,为特异性检测血清中ALT1蛋白提供了有力的依据,同时也有利于初步探讨人血清中ALT1分布水平与ALT活性的关系。方法:利用RT-PCR方法从人肝癌细胞(HepG2)扩增回收完整的ALT1基因,采用基因重组技术与pET32a(+)质粒连接,获得含有ALT1完整基因的重组质粒。并将构建好的原核表达载体pET32a(+)-ALT1转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用镍柱(Ni2+)亲和层析法纯化ALT1重组蛋白。用纯化后的蛋白免疫Balb/c小鼠,并将经过四次免疫后的小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。酶联免疫吸附实验(ELISA)和有限稀释法进行克隆筛选,至挑选出单一并且能够稳定分泌特异性MAb的杂交瘤细胞株。采用双抗体夹心ELISA法筛选出一对特异性的单抗,用于制备胶体金免疫层析试纸条。对试纸条的灵敏度和特异性进行分析后,检测不同ALT活性的人血清样本。结果:通过原核表达制备出了ALT1重组蛋白。以纯化后的ALT1作为抗原免疫Balb/c小鼠,并且采用杂交瘤细胞技术,获得了8株单一且能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。并采用双抗体夹心ELISA法筛选出BD7和DG3配对的MAb,经过验证这对单克隆抗体具有高度的特异性、抗体效价及亲和力。并且根据筛选出的单克隆抗体BD7和DG3,制备出了具有高度灵敏度和特异性的ALT1胶体金快速检测试纸条。试纸条能够检测的最低ALT1活性为12U/L,且特异性高与其他蛋白没有交叉反应。结论:以原核表达出的ALT1重组蛋白为基础,通过杂交瘤细胞技术以及抗体配对筛选,获得了2株具有高度特异性、抗体效价及亲和力的单克隆抗体BD7和DG3,并成功制备出具有高度灵敏度和特异性的ALT1胶体金免疫层析试纸条,为特异性检测血清中ALT1蛋白提供了有力的依据,为进一步探讨ALT1同工酶的分布水平与ALT活性关系奠定了基础。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R446.6

【参考文献】

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1 赵志强;郑小林;张思杰;韦晓兰;;细胞融合技术[J];生物学通报;2005年10期

2 韩中治,王先鸣,常若云;血清丙氨酸氨基移换酶活力连续监测方法探讨[J];陕西医学检验;1999年04期

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本文编号：1250130