ST37型艰难梭菌耐药特征及其应用MALDI-TOF MS快速鉴定方法的建立

发布时间：2018-01-01 05:41

本文关键词：ST37型艰难梭菌耐药特征及其应用MALDI-TOF MS快速鉴定方法的建立　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:艰难梭菌(Clostridium difficile,CD)是一种专性厌氧,革兰阳性的粗大芽孢杆菌,是引起抗生素相关性腹泻(AAD)和院内感染的主要病原菌。艰难梭菌导致人类腹泻的主要致病机制与该菌产生的两种毒素有关,肠毒素A(Tcd A)和细胞毒素B(Tcd B)。高产毒株核糖体(RT)027型菌株能够产生第三种毒素——二元毒素(CDT)。近年来,RT027型等高产毒株的出现已经导致北美和欧洲地区医院内的多次暴发流行。而亚洲地区分离率最高的型别主要是RT017型,即多位点序列分型(MLST)37型。ST37型艰难梭菌仅产生毒素B,不产生毒素A,却仍有很强的致病性。相比其他型别,ST37型艰难梭菌对氟喹诺酮类、大环内脂类、林可霉素类等多种抗生素的耐药率明显增高,是引起成人艰难梭菌感染(CDI)最主要的型别。由ST37型艰难梭菌感染导致的严重临床症状和暴发流行时有报道,对公共卫生安全造成严重威胁。因此,快速鉴定ST37型艰难梭菌对预防我国艰难梭菌暴发流行至关重要。目前,常用的分型方法有PCR-核糖体分型、MLST和脉冲场凝胶电泳分型(PFGE)等,但是由于这些方法耗时长、价格昂贵,且需要使用专门仪器设备,很难在临床实验室中常规应用。本研究建立了一种基于基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)快速检测ST37型艰难梭菌的方法,将对艰难梭菌感染的防控起到重要作用。方法:159株菌种均来自河北省医学微生物菌种保藏中心(HBCMCC)。其中,65株收集于腹泻患者,87株收集于健康成人或儿童,另外包含7株标准菌株(ATCC BAA-1870,ATCC BAA-1382,ATCC BAA-1812,ATCC BAA-1804,ATCC 9689,ATCC 43255和ATCC 43598)。159株菌通过MALDI-TOF MS和16s r DNA测序均被鉴定为艰难梭菌。将实验用所有菌株接种于哥伦比亚血琼脂平板,传代两次,用于后续试验。提取艰难梭菌基因组进行艰难梭菌毒素基因检测以及MLST分型。采用CLSI推荐的琼脂稀释法检测艰难梭菌对临床常用药物的最低抑菌浓度(MIC),共包括13种抗生素:万古霉素、甲硝唑、非达霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、四环素、氯霉素、红霉素、头孢曲松、头孢他啶、利福昔明、美罗培南和克林霉素。菌体蛋白的提取采用乙醇/甲酸法。提取出的蛋白样本通过Microflex LT和VITEK MS两台质谱仪采集质谱数据,通过Clinprotools软件分析建立ST37型艰难梭菌快速鉴定方法,并对该方法的重复性和准确性进行验证。结果:1毒素基因检测结果显示:159株艰难梭菌中,104株为tcd A+tcd B+cdt A-cdt B-,4株为tcd A+tcd B+cdt A+cdt B+,21株为tcd A-tcd B+cdt A-cdt B-,30株为非产毒株tcd A-tcd B-cdt A-cdt B-。MLST分型将所有菌株分为46个ST型,其中最主要的型别为ST3,其次为ST37、ST54、ST2和ST35,包含了河北地区流行的大部分菌株型别。21株tcd A-tcd B+型艰难梭菌主要为ST37型(20/21),另外还有1株为ST81型,而ST81是ST37的单位点变异型(SLV)。此外本研究首次发现2个新ST型(成功注册Griffiths监管的国际艰难梭菌MLST数据库),分别为ST348(等位基因谱1-1-2-3-1-5-3)1株,ST349(等位基因谱1-1-7-1-5-3-1)1株。2与其他ST型艰难梭菌相比,ST37型艰难梭菌对左氧氟沙星、四环素、氯霉素、红霉素、头孢曲松、利福昔明和美罗培南的耐药率更高(P均0.05)。各ST型艰难梭菌对环丙沙星的耐药率没有统计学差异,各ST型艰难梭菌对头孢他啶均耐药,对甲硝唑、万古霉素和非达霉素均敏感。3将ST37型艰难梭菌的蛋白质量图谱与其他ST型艰难梭菌的蛋白质量图谱进行对比发现,ST37型艰难梭菌的蛋白质量图谱中有一组特异性的蛋白峰m/z 3240和m/z 3285。通过检测这组特征峰可以达到快速鉴定ST37型的目的,该方法鉴定ST37型的特异度为99%,灵敏度为95%,阳性预测值为95%,阴性预测值为99%。Microflex LT和VITEK MS两种型号的质谱仪得到了相同的结果。重复性实验结果:27张ST37型菌株图谱均存在m/z 3240和m/z 3285峰,27张非ST37型菌株图谱均不存在m/z3240和m/z 3285峰,m/z 3240和m/z 3285峰在ST37型菌株中有很好的稳定性和重现性。并且,从不同国家和地区收集的38株艰难梭菌(包括22株ST37型和16株非ST37型艰难梭菌)对快速鉴定方法进行验证,其中21株(95.5%)ST37型艰难梭菌被成功鉴定出。结论:1与其他型别相比,ST37型艰难梭菌耐药形势严峻,应警惕抗生素选择压力下,ST37型在医院内暴发流行。2 ST37型艰难梭菌的MALDI-TOF质谱中存在两个特征性蛋白峰m/z 3240和m/z 3285,可以作为ST37型艰难梭菌的生物标志物。3首次建立的基于MALDI-TOF MS的ST37型艰难梭菌快速鉴定技术具有简单、快速、高通量、低成本的特点,适用于CDI的防治和监控工作。
[Abstract]:Objective : Clostridium difficile ( CD ) is a special anaerobic and Gram - positive bacillus , which is the main pathogenic bacterium causing antibiotic - related diarrhea and nosocomial infection . The main pathogenic mechanism of Clostridium difficile is related to the two toxins produced by the bacterium , toxin A ( Tcd A ) and cytotoxin B ( Tcd B ) . This study has established a method for rapid detection of C . difficile infection by MALDI - TOF MS . The results showed that 104 strains were tcd A + tcd B + cdt A - cdt B - , 4 strains were tcd A + tcd B + cdt A + cdt B + , 21 strains were tcd A - cdt B + cdt A - cdt B + cdt A + cdt A - cdt B - , 30 strains were non - producing strain tcd A - tcd B - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt A - cdt B - , 30 strains were non - producing strain tcd A - tcd B - cdt A - cdt B - . The results showed that there were two characteristic protein peaks m / z 3240 and m / z 3285 in 27 strains of ST37 type . The results showed that there were two characteristic protein peaks m / z 3240 and m / z 3285 in 27 strains of ST37 type .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.5

【参考文献】