黄芪甲苷干预腹膜间皮细胞表型转化的分子机制研究

发布时间：2018-01-08 06:25

本文关键词：黄芪甲苷干预腹膜间皮细胞表型转化的分子机制研究　出处：《南京中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景/目的腹膜透析(Peritoneal Dialysis,PD)是终末期肾病替代治疗的主要手段之一。在许多国家和地区被推荐为终末期肾病一体化治疗的首选方式。但令人遗憾的是随着透析时间的延长,PD的透析效能逐年下降,尤其是发生超滤衰竭(ultrafiltration failure,UFF)的发生,成为PD技术失败的主要原因和阻碍PD的进一步发展的主要障碍。UFF的发生的实质腹膜纤维化(Peritoneal Fibrosis,PF)。阐明PD相关性PF的发生机制以及探索保护腹膜结构和功能完整性的策略己成为肾脏替代治疗领域面临的重大挑战。腹膜间皮细胞转分化(Mesothelial-to-Mesenchymal Transition,MMT)被认为是 PF 的早期的、可逆的病理生理过程。因此,如果能够在起始阶段干预腹膜间皮细胞MMT将有可能为拮抗甚至逆转PF提供新的策略。腹膜间皮细胞发生MMT的机制仍不清楚。目前已有的证据认为TGF-β 1/Smad信号通路,是多种外来刺激因素诱导腹膜间皮细胞MMT的发生和进展的共同的、关键的信号通路,并有可能成为干预MMT的新靶点。我们前期的研究表明中药黄芪可以明显提高透析效能,增加透析超滤量,提高腹膜对溶质的清除能力。动物实验的结果表明黄芪减少腹膜组织TGF-β 1、p-Smad2/3在腹膜的表达,而且能够减少腹膜巨噬细胞的募集,减少MCP-1的表达,拮抗腹膜炎症反应。然而确切的分子机制并不清楚。因此本研究的第一部分拟通过构建TGF-β 1诱导的腹膜间皮细胞MMT模型,基于TGF-β 1/Smad信号通路探讨中药黄民有效成分黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)拮抗的腹膜间皮细胞MMT的分子机制。NLRP3炎性体(inflammasome)是胞浆内一组复杂的多蛋白复合体,是caspase-1活化所必需的反应平台,调控IL-1β、IL-18等促炎细胞因子的加工及活化。它主要由NLRP3、ASC(衔接蛋白)、caspase-1(效应蛋白)构成。其中NLRP3是胞浆内最重要的模式识别受体之一,不仅能识别病原体相关分子模式,还能够识别损伤相关的分子模式,NLRP3被激活后起始炎症复合体的组装,招募ASC和Caspase-1,促使自身寡聚体化,使Pro-caspase-1实现空间距离的接近,进而通过自身切割形成成熟的Caspase-1。caspase-1活化后酶切无活性前体形式合成的pro-IL-1β形成有生物活性的成熟IL-1β,是启动IL-1β、IL-18等重要促炎细胞因子产生及分泌的关键步骤。越来越多的研究表明,NLRP3炎性体可能是沟通代谢紊乱和炎症的分子桥梁。除了通过病原微生物模式分子激活外,细胞外高糖、ATP、胆固醇、尿酸结晶、酸中毒等代谢相关的刺激物可以通过离子通道模型、ROS模型、溶酶体破坏模型激活NLRP3炎性体造成组织损伤。因此NLRP3炎症体在慢性无菌性炎症、自身免疫性疾病、代谢性疾病等病理过程中的作用及意义日益受到关注。NLRP3炎症体活化的相关研究主要集中于来源于骨髓的固有免疫细胞,其在腹膜间皮细胞中的病理生理作用仍不清楚。我们知道PMCs长期直接暴露于异常代谢环境(高糖(1.5%-4.25%),高渗(346-490mOsm/L),低PH值(5.0-5.8)和葡萄糖代谢产物的腹膜透析液)中,很可能存在NLRP3炎性体持续活化,产生caspase-1、IL-1β、IL-18等效应分子介导腹膜组织炎症反应和结构重塑。因此本研究第二部分拟通过高糖腹膜透析液诱导腹膜间皮细胞MMT的体外模型证明NLRP3炎性体活化在腹膜间皮细胞MMT的关键作用。另外,有证据表明黄芪及其有效成分黄芪甲苷具有抗炎、调节免疫、抗氧化作用等的现代药理作用,我们前期的研究证明黄芪可以减轻高糖腹膜透析液诱导的腹膜组织局部的炎症反应,拮抗腹膜结构重塑的作用,但是确切的机制并不清楚。因此本部分研究拟回答下列2个问题:NLRP3炎症体的活化是否介导了含糖PD液诱导的腹膜间皮细胞MMT;AS-Ⅳ是否能够阻断NLRP3炎症体的活化从而发挥拮抗腹膜间皮细胞MMT的作用。方法第一部分:①.细胞培养:人腹膜间皮细胞(HMrSV5 cells ATCC)培养于含10%(v/v)胎牛血清和100U/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基中。细胞培养在37℃、5%CO2、饱和湿度条件的细胞培养箱中,观察细胞生长状态,每2天更换培养基。所有的实验在细胞接种如细胞培养板后24h-48h实施。为了诱导HMrSV5细胞发生MMT,用TGF-β1(2ng/ml)处理细胞。②细胞活力实验:应用不同浓度的 AS-Ⅳ(0,10,50,100,200 和 400μg/ml)刺激 24 小时,和 400μg/ml AS-Ⅳ刺激不同时间(0,12,24,36,48和72h)后应用counting kit-8(CCK-8)assay试剂盒进行分析。③细胞被随机分为对照组(0.1%DMSO),AS-Ⅳ单独处理组(4000μg/ml),TGF-β1单独处理组(10ng/ml),TGF-β1+不同浓度AS-Ⅳ或者TGF-β1+NAC组。应用TRIzol法完成总RNA的提取,cDNA的制备以及realtimePCR的操作根据产品操作说明书完成。所以mRNA的定量结果以与内参基因GAPDH比值表示,用2-ΔΔCt法分析数据。RIPA缓冲液裂解细胞后,提取总蛋白,应用BCA Protein Assay试剂盒对总蛋白进行定量,电泳、转膜,第一和第二抗体孵育以及显色均按照产品操作说明进行,用imageJ软件分析数据。④活性氧水平测定:细胞随机分为对照组(0.1%DMSO)、TGF-β1 处理组(10ng/ml)、AS-Ⅳ + TGF-β1 组(提前2小时用400μg/ml AS-Ⅳ预处理+ 2 ng/ml TGF-β1)和NAC组(提前两小时 NAC 100 nM + 2 ng/ml TGF-β1)。用 DCFH2-DA 荧光法检测 ROS 水平。⑤细胞转染实验:用慢病毒转染的方式构建稳定表达目的基因的细胞株。然后将细胞分为对照组(0.1%DMSO),TGF-β1 组(2 ng/ml),AS-Ⅳ + TGF-β1 组(提前 2小时用 400 μg/ml AS-Ⅳ 预处理 + 2 ng/ml TGF-β1),TGF-β1+Smad7 overexpression(OE)组,TGF-β1+AS-Ⅳ+Smad7knockdown(KD)组。然后进行western blotting分析(方法同上)和细胞迁移侵袭实验。第二部分:①为了证明含糖腹透液可以诱导腹膜间皮细胞MMT,并可以诱导NLRP3炎症体活化,细胞随机分为9组:(1)空白组:正常培养液;(2)含1.5%葡萄糖PD液处理24h组;(3)含2.5%葡萄糖PD液处理24h组;(4)含4.25%葡萄糖PD液处理24h组;(5)含4.25%葡萄糖PD液刺激0h;(6)含4.25%葡萄糖PD液刺激6h;(7)含4.25%葡萄糖PD液刺激12h;(8)含4.25%葡萄糖PD液刺激24h;(9)含4.25%葡萄糖PD液刺激48h。收集细胞,提取蛋白并收集细胞上清液分别应用westernblot和ELISA检测各蛋白表达。②为了进一步说明NLRP3炎症体激活在高糖腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞MMT中的关键作用,我们构建了稳定转染NLRP3siRNA的细胞株,阻断细胞内NLRP3表达水平。实验分为5组:(1)正常细胞组;(2)scramble RNA组;(3)siNLRP3组;(4)4.25%腹透液刺激组;(5)4.25%腹透液+siNLRP3组。收集细胞上清并收集细胞、提取蛋白。应用Westernblot检测各组蛋白表达。③为了证明AS-Ⅳ通过抑制NLRP3炎症体的活化部分阻断高糖腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞MMT。细胞随机分为7组:(1)空白组:正常培养液;(2)4.25%腹膜透析液组;(3)AS-Ⅳ(400ug/ml)组;(4)10ug/mlAS-Ⅳ+ 4.25%腹膜透析液;(5)100ug/mlAS-Ⅳ+4.25%腹膜透析液;(6)200ug/mlAS-Ⅳ+4.25%腹膜透析液;(7)400ug/mlAS-Ⅳ+ 4.25%腹膜透析液。细胞提前2h用AS-Ⅳ处理,然后加入4.25%腹膜透析液孵育24小时。收集细胞提取蛋白同时留取细胞培养上清液分别行western blot 和 ELISA 分析。结果第一部分:①不同剂量的AS-Ⅳ处理24小时以及400ug/ml AS-Ⅳ在不同的时间点对于细胞的活力均没有明显影响。②在应用2 ng/ml TGF 0 1刺激24小时以后,腹膜间皮细胞的上皮标志E-Cadherin的表达下调,而间充质细胞标志vimentin,a-SMA以及collagen Ⅰ的表达均上调(P0.05)。与此同时phospho-Smad2/3的表达也显著上调(P0.05),而经过AS-Ⅳ预处理的细胞能够抑制Smad2/3的活化,拮抗TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞MMT。而Smad2/3下游的两个与MMT密切相关的核转录因子snail1和snail2在核酸水平也被AS-Ⅳ所抑制(P0.05)。③在TGF-β1刺激人腹膜间皮细胞后活化Smad2/3,phospho-Smad2/3表达上调,同时Smad7表达下调。而AS-Ⅳ可以剂量依赖性地下调phospho-Smad2/3的表达,与此同时AS-Ⅳ可以在蛋白水平上剂量依赖性地上调smad7的表达。但是在核酸水平,没有观察到AS-Ⅳ对Smad7的影响。另外,无论是在TGF-β 1处理后还是不同剂量的AS-Ⅳ处理后,TGF-β 1的两个主要膜受体TGRBI和TGRBⅡ表达水平均未受影响。④TGF β 1(2 ng/m)刺激腹膜间皮细胞24小时后,活性氧ROS的水平明显升高(P0/05)。无论是AS-Ⅳ还是N-乙酰半胱氨酸(100nM),都可以下调ROS的水平。而N-乙酰半胱氨酸虽然下调了 ROS水平,却没有抑制Smad2/3的活化和TGF-β 1诱导的人腹膜间皮细胞的MMT。⑤慢病毒转染的方式获得了满意的抑制smad7表达和过表达smad7的效果。过表达Smad7可以明显抑制TGF β 1诱导MMT(P0.05)。另外,AS-Ⅳ可以下调vimentin表达的作用可以部分被Smad7的敲除所逆转(P0.05)。应用细胞transwell侵袭实验进一步证明了上述结果。第二部分:①含糖腹膜透析液可以剂量性地上调细胞上清中IL-18的水平。(p0.05)。而4.25%PD液可以呈时间依赖性地上调细胞培养上清液IL-18的水平(p0.05)。应用westemblot检测发现高糖腹膜透析液可以诱导腹膜间皮细胞发生MMT,表现为上皮标志物E-cadherin表达下调,而间充质细胞标志物vimentine、α-SMA表达上调(p0.05),而且上述作用呈现时间和剂量依赖性。高糖腹膜透析液在诱导腹膜间皮细胞发生MMT的过程中,可以呈时间和剂量依赖性地激活了NLRP3 炎症体相关组分(NLRP3、pro-casepase-1、pro-IL-1β、IL-1β)(p0.05)。②应用Westernblot检测各组蛋白表达,结果分析发现NLRP3siRNA可以在蛋白水平稳定的下调NLRP3的表达(p0.05)。4.25%腹膜透析液可以上调NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β 的表达(p0.05),而转染 NLRP3siRNA 能够部分地阻断 4.25%PD液诱导的NLRP3炎症体活化,NLRP3、pro-IL-1β、IL-1β表达下调(p0.05),在这一过程中Pro-caspase-1表达水平无明显变化(p0.05);4.25%腹膜透析液可以诱导腹膜间皮细胞发生MMT,上皮细胞标志物E-cadhrin表达下调,而间充质细胞标志物vimentin和α-SMA表达上调(P0.05)。而NLRP3siRNA能够部分阻断4.25%腹膜透析液诱导的腹膜间皮细胞MMT(p0.05)。进一步应用ELISA方法发现,4.25%腹膜透析液可以上调细胞上清中IL-18的表达(p0.05),而NLRP3 siRNA可以下调细胞上清液中IL-18的水平(p0.05)。③4.25%腹膜透析液处理24h 能够显著诱导 NLRP3 炎症体活化,NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、IL-1β表达上调(p0.05)。同时能够诱导腹膜间皮细胞发生MMT,上皮细胞标志物E-cadherin表达下调而间充质细胞标志蛋白vimentin和α-SMA表达上调(p0.05)。AS-Ⅳ可以浓度依赖性地阻断炎症体的活化,NLRP3、pro-IL-1β、pro-caspase-1、IL-1β表达下调(p0.05),同时可以浓度依赖性地抑制腹膜间皮细胞MMT,上皮细胞标志物E-cadherin表达上调而间充质细胞标志蛋白vimentin和α-SMA表达下调(p0.05)。结论①TGF-β1可以活化Smad2/3并诱导人腹膜间皮细胞HMrSV5发生MMT;②AS-Ⅳ可以通过直接作用于smad7,上调Smad7的表达,从而抑制Smad2/3活化,发挥拮抗TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞MMT的作用;③AS-Ⅳ拮抗TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞MMT的作用是独立于其抗氧化作用之外的。④高NLRP3炎症体活化介导了高糖PD液诱导的腹膜间皮细胞MMT;⑤AS-Ⅳ可以通过抑制NLRP3炎症体的活化部分阻断高糖PD液诱导的腹膜间皮细胞MMT。
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【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R459.5

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