间歇性碱刺激对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制研究

发布时间：2018-01-09 09:16

本文关键词：间歇性碱刺激对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响及机制研究　出处：《河北医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者的全因死亡率逐年上升,其中心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)是MHD患者的主要死亡原因之一,而血管钙化是其最常见的病理表现,据统计表明,血管钙化导致的死亡率约占MHD患者总病死率的30%左右。影响MHD患者血管钙化的危险因素众多,如高龄、贫血、高脂血症、高磷血症以及长透析龄等危险因素。但传统危险因素已不能完全解释MHD患者血管钙化,因此,本课题组前期研究发现,酸性环境抑制VSMCs钙化,碱性环境促进VSMCs钙化。然而,间歇性碱刺激对VSMCs钙化的影响及其可能的机制尚未完全明确,因此本研究将通过模拟MHD患者体内特有的p H变化规律,探讨间歇性碱刺激对VSMCs钙化的影响及可能机制。方法:1 VSMCs的原代培养及实验分组将血管外膜轻轻剥除,纵行剖开血管,用无菌纱布轻轻擦除内膜,应用组织贴壁法进行VSMCs原代培养,并进行鉴定。经自然纯化后,选取生长良好的4代细胞进行实验。采用随机数字表法,将VSMCs随机分为6组:正常对照组、高磷+p H7.4组、高磷+p H7.5组、高磷+p H7.6组、高磷+p H7.7组及维拉帕米干预组。干预4 d后,提取各组细胞m RNA和蛋白,进行RNA及蛋白水平检测,干预14 d后进行钙化检测。2血管环的培养及实验分组体外分离大鼠胸主动脉血管环,采用随机数字表法,将VSMCs随机分为6组:正常对照组、高磷+p H7.4组、高磷+p H7.5组、高磷+p H7.6组、高磷+p H7.7组及维拉帕米干预组。干预14天后,用组织免疫组化方法检测LTCCβ3、SM22α和Runx2表达情况,并进行钙化检测。3 RT-PCR和Western印迹法检测各目的基因及蛋白的表达细胞干预4天后,分别提取正常对照组、高磷+p H7.4组、高磷+p H7.5组、高磷+p H7.6组、高磷+p H7.7组及维拉帕米干预组m RNA和蛋白,用RT-PCR和Western Blot方法测定L型钙通道(calcium channels,L-type,LTCC)β3亚基和Runx2的表达情况。4免疫组化方法检测血管环各目的蛋白表达取石蜡切片(3μm)常规脱蜡,用EDTA高压锅煮沸抗原修复,3%H2O2消除内源性过氧化物酶,山羊血清封闭,滴加一抗:LTCCβ3亚基(1:50)、Runx2(1:100)、SM22α(1:100),放入4℃过夜;滴加第二代生物素标记的二抗工作液和辣根酶标记链酶卵白素工作液,DAB显色,显微镜下观察,蒸馏水终止反应,苏木素复染,明显棕黄色颗粒为阳性,不着色为阴性。5 VSMCs钙化情况及ALP活性测定VSMCs钙含量测定:细胞干预14天,用BCA法测定细胞钙含量,钙含量(mg/g)用蛋白含量校准。茜素红染色:细胞干预14天,加入茜素红染液,放入37℃温箱赋育30 min,橘红色为钙盐沉积。ALP活性测定:使用ALP活性试剂盒测定其活性,结果用蛋白含量校准。6血管环钙化情况测定血管环钙含量测定:血管环干预14天后用邻甲酚酞络合酮比色法测定钙含量,以mg/g为单位。硝酸银钙化染色:血管环干预14天后常规脱蜡、脱水,滴加5%硝酸银溶液,紫外光照射60 min,5%硫代硫酸钠溶液定影,碱性品红复染,钙盐沉积处被染为黑褐色。7 VSMCs钙离子浓度测定细胞干预4天后,使用钙离子探针技术检测VSMCs内钙离子浓度。8统计学处理应用SPSS17.0软件进行数据统计学分析,实验数据应用均数±标准差表示,多组间均数差异比较应用单因素方差分析(ANOVA),组间均数两两比较应用SNK检验,P0.05认为差异有统计学意义。结果:1间歇性碱刺激对高磷诱导的VSMCs钙化影响VSMCs茜素红染色与钙含量测定结果一致,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组钙盐沉积增多(P0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.5组钙盐沉积增多(P0.05);与高磷+p H7.5组相比,高磷+p H7.6组钙盐沉积增多(P0.05);与高磷+p H7.6组相比,高磷+p H7.7组钙盐沉积增多(P0.05);与高磷+p H7.7组相比,维拉帕米干预组钙盐沉积减少(P0.05)。2间歇性碱刺激对高磷诱导的血管环钙化影响血管环VonKossa染色与钙含量测定结果一致,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组钙化结节增多(P0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.5组钙化结节增多(P0.05);与高磷+p H7.5组相比,高磷+p H7.6组钙化结节增多(P0.05);与高磷+p H7.6组相比,高磷+p H7.7组钙化结节增多(P0.05);与高磷+p H7.7组相比,维拉帕米干预组钙化结节减少(P0.05)。3间歇性碱刺激对高磷诱导的VSMCs Runx2表达和ALP活性的影响RT-PCR和Western-blot结果均显示,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组Runx2表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.5组Runx2表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.5组相比,高磷+p H7.6组Runx2表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.6组相比,高磷+p H7.7组Runx2表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.7组相比,维拉帕米干预组Runx2表达水平降低(P0.05)。ALP活性测定结果显示,间歇性碱刺激增加ALP活性(P0.05),维拉帕米抑制ALP活性(P0.05)。4间歇性碱刺激对高磷诱导的血管环Runx2和SM22α表达的影响免疫组化结果显示,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组Runx2表达水平增高(P0.05),SM22α表达水平降低(P0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.5组Runx2表达水平增高(P0.05),SM22α表达水平降低(P0.05);与高磷+p H7.5组相比,高磷+p H7.6组Runx2表达水平增高(P0.05),SM22α表达水平降低(P0.05);与高磷+p H7.6组相比,高磷+p H7.7组Runx2表达水平增高(P0.05),SM22α表达水平降低(P0.05);与高磷+p H7.7组相比,维拉帕米干预组Runx2表达水平降低(P0.05),SM22α表达水平增高(P0.05)。5间歇性碱刺激对高磷诱导的VSMCs的LTCCβ3亚基表达及钙离子内流效应的影响RT-PCR和Western-blot结果均显示,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.5组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.5组相比,高磷+p H7.6组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.6组相比,高磷+p H7.7组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.7组相比,维拉帕米干预组LTCCβ3亚基表达水平降低(P0.05)。荧光显色结果显示,间歇性碱刺激增加VSMCs内钙离子荧光强度(P0.05),维拉帕米抑制减少VSMCs内钙离子荧光强度(P0.05)。6间歇性碱刺激对高磷诱导的血管环LTCCβ3亚基表达的影响免疫组化结果显示,与正常对照组相比,高磷+p H7.4组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.4组相比,高磷+p H7.5组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.5组相比,高磷+p H7.6组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.6组相比,高磷+p H7.7组LTCCβ3亚基表达水平增高(P0.05);与高磷+p H7.7组相比,维拉帕米干预组LTCCβ3亚基表达水平降低(P0.05)。结论:间歇性碱刺激促进高磷诱导的VSMCs的血管钙化,其机制可能与间歇性碱刺激上调L型钙通道β3亚基表达,进而增加钙离子内流,促进VSMCs成骨成软骨样表型转化有关。
[Abstract]:Objective : To study the effect and possible mechanism of intermittent base stimulation on calcification in MHD patients . Immunohistochemical method was used to detect the expression of 尾 - 3 subunit and Runx2 in normal control group , high - phosphorus + p - H7 . 6 group , high - phosphorus + p - H7 . 5 group , high - phosphorus + p - H7 . 6 group , high - phosphorus + p - H7 . The calcium ion concentration in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the normal control group , the calcium salt deposition increased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the calcium salt deposition in high P + p H7 group increased ( P0.05 ) . Compared with the control group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with normal control group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the high P + p H7 group , the expression level of Runx2 in high P + p H7 group was increased ( P0.05 ) . Compared with the high P + p H7 group , the expression level of lt尾3 subunit in high P + p H7 group increased significantly ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R459.5;R54

【参考文献】