CTX-M-55型超广谱β-内酰胺酶的分布、进化及抗药活性研究

发布时间：2018-01-21 17:38

本文关键词： CTX-M-55 分布特征分子进化抗药活性　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的CTX-M-55型ESBL,最初于2005在泰国被发现报道,与CTX-M-3型ESBL相比较,其有两个氨基酸位点突变,即在第77位的缬氨酸取代原来的丙氨酸,第240位的甘氨酸取代天冬氨酸。不同国家不同地域,CTX-M-55型ESBL的分布流行情况不同。同一国家的不同地区,CTX-M-55的分布流行情况也存在差异。目前,河南地区CTX-M-55型ESBL的流行分布情况尚不明确。在本课题组前期进行的CTX-M型分子进化研究中,已经发现在肺炎克雷伯菌中存在头孢噻肟酶的一条进化路径,即CTX-M-3→CTX-M-15→CTX-M-55。但由于编码CTX-M型ESBL的耐药基因可以在不同菌种间通过质粒水平传播,目前河南地区与CTX-M-55型ESBL相关酶型是否存在其他的进化路径及进化节点,仍需要进一步的分析研究。本课题组通过检测质粒转移接合子的抗药活性来间接反映CTX-M型ESBL的抗药活性。但是由于携带bla CTX-M-55耐药基因的质粒往往携带有其他耐药基因,该种方法并不能客观评价单一CTX-M-55型ESBL的抗药活性。为解决以上问题,我们设计了该课题。旨在通过临床标本分离菌的统计分析及相关分子生物学检测,探明河南地区CTX-M-55型ESBL的分布特征;通过构建分子进化树,明确与CTX-M-55型ESBL相关的进化路径和进化节点;通过构建CTX-M-55转化子,客观评价CTX-M-55型ESBL抗药活性,最终为临床抗携带CTX-M-55型ESBL菌株感染治疗提供实验室指导。第一部分:CTX-M-55型超广谱β-内酰胺酶的分布及进化研究方法(1)菌株收集及药敏实验收集郑州大学第一附属医院检验科微生物实验室2015年9月份至2016年6月份三代头孢菌素耐药的革兰阴性杆菌300株。药敏试验根据CLSI 2015判断结果(2)ESBL表型确证实验按CLSI推荐方法进行ESBL表型确证实验(3)普通PCR初筛产blaCTX-M-55-like菌株(4)blaCTX-M-55-like耐药基因的全长序列扩增及测序。(5)ERIC1-PCR检测菌株同源性(6)普通PCR检测其他ESBL编码基因(7)进化分析采用MEGA6.0软件构建系统进化树,采用NETWORK软件进行进化节点分析。结果1.CTX-M型ESBL在革兰阴性菌中的分布情况23%的革兰阴性菌为产CTX-M型ESBL菌株,依次为CTX-M-3(42.1%),CTX-M-15(33.4%),CTX-M-55(20.3%),CTX-M-64(n=1.4%),CTX-M-136(1.4%)和CTX-M-187(1.4%)。2.产CTX-M-55型ESBL菌株的临床分布流行特征及耐药表型产CTX-M-55型ESBL菌株主要为大肠埃希菌,主要分布在外科科室,主要分离于血液标本。药敏结果显示该类菌株对头孢噻肟与头孢他啶的耐药率极高,均为92.86%。对哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星有较好的敏感性。3.CTX-M-55型ESBL在各菌种间的分布情况CTX-M-55型ESBL主要分布于大肠埃希菌(9/14),肺炎克雷伯菌(3/14),弗氏柠檬酸杆菌(1/14)和摩根摩根菌(1/14)。ERIC结果显示各菌株均不同源。4.河南地区blaCTX-M-55耐药基因相关进化路径及进化节点分析在大肠埃希菌中存在头孢噻肟酶的新进化节点即CTX-M-136。第二部分CTX-M-55型超广谱β-内酰胺酶的抗药活性研究方法(1)构建p UCm-T-CTX-M-55克隆载体(2)构建p ET-30a(+)-CTX-M-55表达载体(3)CTX-M-55型ESBL的诱导表达采用SDS-PAGE电泳与考马斯亮蓝染色检测CTX-M-55型ESBL融合蛋白表达情况。(4)CTX-M-55转化子抗药活性检测采用VetekⅡ全自动微生物鉴定及药敏检测系统检测CTX-M-55转化子活性,以2015年CLSI为结果判断标准。结果1.成功构建p UCm-T-CTX-M-55克隆载体。2.成功构建p ET-30a(+)-CTX-M-55表达载体。3.CTX-M-55型ESBL融合蛋白主要为上清表达。4.上清表达最佳诱导条件:IPTG 0.5m M,温度11℃,过夜诱导。5.CTX-M-55转化子对青霉素、头孢菌素一代、三代及四代中多数药物耐药,且对头孢噻肟的水解活性强于头孢他啶。对氨基糖胺类、氟奎诺酮类和碳青霉烯类、加酶抑制剂类表现敏感。结论1.河南地区大肠埃希菌是CTX-M-55型ESBL主要携带菌株。2.河南地区首次检出CTX-M-136型ESBL和CTX-M-187型ESBL,其中CTX-M-187型ESBL为世界首次报道。3.在大肠埃希菌中存在头孢噻肟酶的新进化节点:CTX-M-136。4.CTX-M-55转化子具有产ESBL菌株的抗药活性。
[Abstract]:The distribution and evolution of CTX - M - 55 ESBL in Henan Province were investigated by means of statistical analysis and molecular biological detection of CTX - M - 55 ESBL . ( 4 ) CTX - M - 55 type ESBL was used to detect CTX - M - 55 expression vector . Results 1 . CTX - M - 55 type ESBL was successfully constructed .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.5

【相似文献】