脓毒症过程中细胞外组蛋白对肾小管上皮细胞凋亡的作用及机制研究

发布时间：2018-02-27 12:40

本文关键词： 脓毒症组蛋白急性肾损伤肾小管上皮细胞凋亡　出处：《南方医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是脓毒症发展过程中最常见且最严重的并发症之一。与非脓毒症AKI不同,脓毒症AKI最主要的致病因素是肾小管上皮细胞凋亡。有研究指出细胞外组蛋白参与了 AKI的发病过程,而关于脓毒症的研究则指出细胞外组蛋白是导致脓毒症患者死亡的主要因素。因此,本研究将在前期实验和文献分析的基础上探索细胞外组蛋白在脓毒症过程中引起AKI的机制。研究目的1.细胞外组蛋白是否可以诱导肾小管上皮细胞凋亡;2.细胞外组蛋白是否通过线粒体途径诱导肾小管上皮细胞凋亡。研究方法体外实验:1.细胞外组蛋白对HK-2细胞凋亡的诱导作用将50μg/ml组蛋白以等体积培养基作为对照(下同)与人肾小管上皮细胞(human kidney-2 cell,HK-2)细胞株共培养,分别在培养2h、4h和6h时用流式细胞仪检测HK-2细胞的凋亡率,明确细胞外组蛋白的最佳培养时间(本实验为4h)后换不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)的组蛋白与HK-2细胞共培养,用流式细胞仪检测凋亡率并明确细胞外组蛋白作用是否存在浓度依赖性。2.细胞外组蛋白通过线粒体途径诱导HK-2细胞凋亡将不同浓度的组蛋白(25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)与HK-2细胞共培养,4h后进行罗丹明123(Rhodamine 123,Rho 123)染色、提取细胞蛋白,流式细胞仪检测线粒体膜电位变化情况;Western Blot法检测线粒体膜蛋白Bcl-2、MAPK p38磷酸化蛋白(p-p38)、Caspase-9及Caspase-3蛋白的表达量。体内实验:将不同浓度(50mg/kg、100mg/kg)的组蛋白以等量生理盐水作为对照,经尾静脉注射至BALB/c小鼠体内,观察6h,眼眶取血后处死,取出小鼠肾脏并去除肾蒂及包膜。部分肾组织研磨后制成细胞悬液用流式细胞仪检测细胞凋亡;部分肾组织留作病理标本,行TUNEL染色;部分肾组织用于提取蛋白,Western Blot法检测Bcl-2、MAPK p38磷酸化蛋白的表达情况。分离小鼠血清用于检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及胱抑素C(Cys C)等肾功能指标。数据分析方法采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析,分析结果用均数±标准差(X±S)表示。各组间均数差异显著性的比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)表示;各组间两两比较用2-tailed student's t检验表示,P0.05表示差异有统计学意义。用Kaplan-Meier法进行生存分析,P0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.体外实验结果与对照组相比,各组蛋白浓度组HK-2细胞凋亡率明显增高,存在显著性差异(P0.01);MAPK p38磷酸化蛋白、Caspase-9及Caspase-3蛋白表达量增高,Bcl-2蛋白表达量降低,差异有统计学意义(P0.05);各组蛋白浓度组线粒体膜电位较对照组明显下降(P0.01)。2.体内实验结果与对照组相比,组蛋白100mg/kg组小鼠累计生存率明显降低(P=0.001),50mg/kg组小鼠生存率无显著差异(P=0.055);各组蛋白浓度组小鼠与对照组相比,肾脏细胞凋亡率增高、MAPK p38磷酸化蛋白表达量增高、Bcl-2蛋白表达量下降,差异均有统计学意义(P0.05);组蛋白100mg/kg组小鼠血清肌酐值较对照组明显升高(P0.01);此外,小鼠肾脏病理切片TUNEL染色细胞凋亡数量也明显增多。实验结论体内与体外实验结果表明脓毒症过程中细胞外组蛋白可以激活MAPK p38通路并作用于线粒体途径诱导肾小管上皮细胞凋亡,进而造成急性肾损伤。
[Abstract]:The apoptosis of human renal tubular epithelial cells was studied by flow cytometry . Compared with the control group , there was no significant difference in the expression of MAPK p38 phosphorylated protein , Caspase - 9 and Caspase - 3 protein ( P = 0 . 05 ) .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R459.7

【参考文献】