基于iTRAQ技术的脂多糖诱导早期内毒素耐受相关蛋白的筛选

发布时间：2018-03-09 09:27

本文选题：内毒素耐受　切入点：巨噬细胞RAW264.7　出处：《西南医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:构建小鼠巨噬细胞RAW264.7内毒素耐受和脓毒症模型,使用iTRAQ技术分析内毒素耐受状态下与脓毒症状态下差异性蛋白的表达,探讨早期内毒素耐受机制。方法:1、用含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基(完全培养基)体外培养小鼠巨噬细胞RAW246.7,获取活力良好的细胞后,取对数期细胞,计数板计数,调浓度为5×105/ml,接种于6cm培养皿,使用随机数字法分成2组,分别为内毒素耐受组(耐受组)和脓毒症组,两组种板后均用完全培养基培养24h。2、24h后更换培养液,耐受组用含10ng/ml LPS的完全培养基3ml,预处理细胞24h,脓毒症组用完全培养基3ml培养24h,24h后两组再次更换培养液,用含100ng/ml LPS的完全培养基刺激细胞4h、24h;3、刺激4h后,(1)离心,取细胞沉淀,于-80℃冰箱保存,收集培养液上清,在实验过程中显微镜观察各组细胞形态变化并拍照。(2)取培养液上清液行ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-10。(3)流式细胞术检测巨噬细胞膜上CD16/32表达。(4)提取蛋白,进行iTRAQ标记,筛选出差异蛋白,然后使用生物信息学分析(GO注释、KEGG信号通路,蛋白网络互作图、韦恩图)。4、刺激24h后,用流式细胞术检测巨噬细胞膜上CD16/32表达。5、细胞处理及样本留取采用3次生物学重复,收集和统计数据,分析结果。结果:1、耐受组预处理后较脓毒症组巨噬细胞活化明显,伸出伪足,表面积变大,贴壁更紧密。2、ELISA检测细胞因子浓度:耐受组刺激4h时细胞上清中TNF-α水平(18273.5±10154.4pg/ml)较脓毒症组(133233.7±68955.9pg/ml)明显降低,差异有统计学意义,p值0.05,且细胞上清中il-6水平(1549.8±399.2pg/ml)较脓毒症组(3175.8±959.0pg/ml)明显降低,差异有统计学意义,p值0.05;但il-10水平(351.1±184.2pg/ml)较脓毒症组(220.3±121.4pg/ml)略有升高,无统计学差别,p值0.05。3、流式细胞术检测巨噬细胞膜上cd16/32表达:耐受组刺激4h后细胞表面cd16/32阳性率(75.33%)较脓毒症组(49.69%)高,p0.05;刺激24h细胞表面cd16/32阳性率(79.07%)较脓毒症组(94.27%)低,p0.05,但与阴性对照组(54.11%)相比,脓毒症组和耐受组cd16/32均增高,p0.05。4、刺激4h后,用itraq技术分析,两组共鉴定到4086个蛋白,而耐受组与脓毒症组的总蛋白比较,有63个显著差异表达蛋白,其中36个上调(比值1.2),27个蛋白下调(比值0.833)。对这些差异表达的蛋白进行生物信息学分析得到如下结果:(1)go注释:差异蛋白的生物学过程主要参与器官组织生长发育、生物质量调节、外界刺激反应;分子功能主要是氧化还原酶激活、受体连接、dna连接、抗氧化活性;细胞组分涉及染色质、胞外区、膜小泡、细胞质囊泡。(2)kegg信号通路分析63个差异蛋白共获得112条信号通路,其中p0.05的信号通路有27条,主要有tlr信号通路、nf-κb信号通路和tnf信号通路以及ppar信号通路。(3)蛋白互作网络图中见hmga1、hmga2、hmgb1、hmgb2蛋白存在相互关联。(4)韦恩图中完全重叠部分共有差异蛋白35个,其中21个蛋白上调,14个蛋白下调。结论:1、初始10ng/mllps预处理24小时,随后100ng/mllps刺激4小时能诱导出巨噬细胞早期内毒素耐受模型。2、在内毒素耐受早期状态时促炎因子tnf-α、il-6表达降低,il-10水平略有升高。3、使用iTRAQ技术能鉴定出蛋白并进行早期内毒素耐受差异蛋白的筛选,生物信息学对这些可能与早期内毒素耐受相关的蛋白进行分析,有助于总结可能参与内毒素耐受的蛋白的功能、所在的细胞成分及蛋白间相互联系、可能相关的信号通路。
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【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R459.7

【参考文献】