TP53INP1在电离辐射诱导乳腺癌细胞MCF-7自噬中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-20 19:48

本文选题：乳腺癌　切入点：自噬　出处：《吉林大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：乳腺癌(Breast Cancer,BC)是全世界妇女中最常见的癌症,据估计,每年大约有130万女性罹患BC。BC在女性癌症死亡率中排在第二位,在发达国家和发展中国家造成每年约35万妇女的死亡。许多因素参与了BC的发病机制和进展,包括遗传、生物和环境因素,以及生活方式。放射治疗(RT)是乳腺癌治疗的方法之一,其治疗效果取决电离辐射作用的肿瘤靶区以及优化的照射方案(单次剂量、累积剂量、分割方案等),最终达到优先杀死肿瘤细胞少伤害正常细胞的作用。电离辐射可引起肿瘤细胞不同类型的死亡,其中包括:凋亡、自噬、坏死、有丝分裂灾难(MC)等。电离辐射诱导的自噬在肿瘤细胞中作用机制较为复杂,尤其是在自噬基因Beclin-1单等位缺失的乳腺癌中。TP53INP(肿瘤蛋白53诱导核蛋白)家族包括TP53INP1和TP53INP2。TP53INP1在1990年代末由三个不同的独立实验室发现,2002年,人类基因组基因命名委员会最终确认基因为TP53INP1,在人类基因中,TP53INP1基因定位于染色体上8q22。已有的研究发现TP53INP1是一个抑癌基因,在多数肿瘤细胞中表达低。TP53INP1是p53的一个重要靶基因,TP53INP1的表达可由p53、p73、E2F1等转录因子调控。已有研究证实TP53INP1可与MAPLC3、GABARAP和GABARAP样蛋白2相互作用,TP53INP1的氨基末端部分含有LC3相互作用区域(LIR)可与MAPLC3相互作用,TP53INP1促进自噬性细胞死亡。我课题组在乳腺癌细胞MCF-7中证实电离辐射引起TP53INP1表达增加,因而TP53INP1在电离辐射引起的乳腺癌细胞自噬中所起的作用值得深入探讨。目的:本论文拟阐述TP53INP1在电离辐射诱导乳腺癌细胞自噬中的作用及机制,发现电离辐射诱导自噬中新的调控通路,为放射治疗肿瘤提供新的靶点,提高肿瘤放疗的效果。方法:1.选取人乳腺癌细胞株MCF-7,构建稳定的TP53INP1基因沉默细胞模型(TP53INP1Ri)及对照的空载体(p SUPER)细胞。2.用深部X射线照射机照射细胞,照射剂量分别为0、2、4、6、8Gy,照射的剂量率为1.02Gy/min、靶皮距70cm。3.采用台盼蓝染色法检测照射后的细胞死亡率,并用流式细胞仪进行分析。4.基因工程构建并转染RFP-LC3进入细胞,荧光显微镜观察细胞的自噬。5.应用集落形成法检测电离辐射后的细胞存活情况。6.采用荧光染色流式细胞术检测自噬与凋亡。7.蛋白表达采用Western blot检测。8.用免疫荧光抗体染色检测不同蛋白质在细胞内定位。9.免疫共沉淀法检测不同蛋白质之间的相互作用。10.染色质免疫共沉淀法检测DNA与蛋白质之间的相互作用。结果:1电离辐射诱导乳腺癌MCF-7细胞自噬分别采用MDC染色形态学观察法、流式细胞术检测在不同剂量照射后,即0、2、4、6、8Gy照射后自噬的变化,结果发现照射组细胞中自噬空泡明显增多并且自噬的发生率呈现剂量依赖性增加。微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,MAPLC3)是哺乳动物中酵母自噬相关基因atg8的同源体,是自噬起始因子。细胞内发生自噬时LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上。因而将MCF-7细胞中转染RFP-LC3质粒(RFP-LC3),选取4Gy照射转染RFP-LC3的细胞后24小时,通过荧光显微镜观察细胞中RFP-LC3的表达,镜下图像可见MAPLC3的点状聚集明显增多。4Gy照射后24小时通过Western blot检测MCF-7细胞中自噬相关蛋白MAPLC3和Beclin1的表达,结果表明细胞照射后MAPLC3和Beclin1表达均增加,提示电离辐射诱导MCF-7细胞发生自噬。2电离辐射诱导MCF-7细胞发生自噬性死亡用台盼蓝染色流式细胞术分析检测细胞自噬发生率最高的8Gy照射后1、2、4、12、24、48、72小时MCF-7细胞的死亡率,结果发现MCF-7细胞死亡率呈现时间依赖性增加。3-甲基腺苷(3MA)是自噬抑制剂,通过抑制Beclin1-Ptd Ins3KC3复合物的形成抑制细胞质中LC3-I转化为LC3-Ⅱ,从而抑制自噬体的形成。将MCF-7细胞中加入3MA,再给予0、2、4、6、8Gy照射,采用MDC染色后流式细胞仪检测,结果发现照射后有3MA组较无3MA组细胞存活率明显增加。进一步通过流式细胞仪检测3MA作用与非作用的MCF-7细胞4Gy照射后细胞自噬与凋亡的变化,结果表明3MA作用后抑制电离辐射诱导的细胞自噬,而对细胞凋亡抑制作用不显著。沉默MCF-7细胞中自噬相关基因Beclin1和ATG5,4Gy照射后台盼蓝染色检测细胞的死亡率,发现照射引起的细胞死亡发生逆转,提示电离辐射诱导自噬性细胞死亡。3 TP53INP1参与电离辐射引起的自噬首先通过高通量基因芯片分析,发现电离辐射引起乳腺癌MCF-7细胞中TP53INP1上调,通过Western blot实验也进一步证实TP53INP1表达增加。为研究TP53INP1是否参与电离辐射引起的自噬,我们构建了TP53INP1Ri以及对照的空载体p SUPER细胞模型。选取五个剂量点0、2、4、6、8Gy照射细胞模型,通过细胞集落形成实验发现,TP53INP1Ri与p SUPER相比6、8Gy照射后细胞存活分数明显增加。将处于对数生长期的TP53INP1Ri与p SUPER细胞种入九十六孔板内,给予8 Gy照射,照射前分别加入自噬抑制剂(1mmol/L)3MA和自噬诱导剂(100nmol/L)雷帕霉素,照射后48小时通过CCK-8方法检测细胞的存活率,结果表明,与p SUPER相比,TP53INP1Ri细胞3MA作用后细胞增殖效果明显,雷帕霉素作用后则增值效果无差异。8Gy照射后24小时用流式细胞仪分析细胞自噬和凋亡的变化,结果显示,与p SUPER相比,电离辐射后TP53INP1Ri细胞自噬的发生率明显降低,而细胞凋亡的变化并不明显。已有相关文献证实,TP53INP1的氨基末端部分包含一个与LC3可以相互作用的一部分区域(LIR),使得TP53INP1和LC3之间可以相互作用,TP53INP1参与自噬并促进自噬性细胞死亡。电离辐射后这种作用机制是否存在,我们通过免疫荧光法发现8Gy照射后24小时MCF-7细胞中TP53INP1与自噬蛋白LC3存在共定位。并且TP53INP1 Ri细胞在8Gy照射后24小时其MAPLC3的表达与p SUPER细胞相比明显降低,提示TP53INP1参与电离辐射引起的自噬。4 TP53INP1与p53之间存在相互作用TP53INP1是p53的靶基因,我实验室已经证实电离辐射后p53表达增加并且调控DRAM促进乳腺癌MCF-7细胞发生自噬,那么p53是否也与TP53INP1存在相互作用,电离辐射后二者是否存在关联?首先通过免疫荧光法证实了电离辐射后TP53INP1与p53在MCF-7细胞内存在共定位。通过IP(免疫共沉淀法)实验进一步证实8Gy照射后TP53INP1与p53存在相互作用,但与非照射组相比这种相互作用并无增强的趋势。将沉默TP53INP1的细胞经8Gy照射后Q-PCR和WB结果表明电离辐射后沉默TP53INP1不能影响p53蛋白的表达。将沉默p53的细胞模型经8Gy照射后Q-PCR检测结果发现电离辐射后沉默p53可降低TP53INP1m RNA的表达,但WB结果表明沉默p53对TP53INP1蛋白的表达影响并不显著。这些结果表明电离辐射后p53对TP53INP1的表达无直接影响,可能通过相互作用发挥调控。5 TP53INP1与STAT3之间存在相互作用8Gy照射后24小时收集TP53INP1Ri和p SUPER细胞并提取RNA做基因表达谱芯片,结果发现,TP53INP1沉默后STAT3的表达也降低。为验证这一结论,通过Western blot实验得到了证实。STAT3(信号转导和转录激活因子3)作为转录因子通过与细胞表面的多肽受体相互作用调控细胞外信号通路如细胞因子和生长因子,STAT3蛋白主要通过酪氨酸磷酸化激活转录,STAT3这个核转录因子可调控超过1000种基因产物的表达。那么二者之间是否存在关联未见有相关文献报道,为证实二者之间的关系,首先通过免疫荧光法确认TP53INP1与STAT3在细胞内共定位,进而通过IP(免疫共沉淀法)实验发现8Gy照射后TP53INP1与STAT3相互作用与非照射组相比明显增强。为证实二者之间是否存在转录水平的调控,进一步应用CHIP染色质免疫共沉淀技术发现STAT3作为转录因子可以结合在TP53INP1的启动子序列。将MCF-7细胞瞬时转染STAT3si RNA,WB验证转染后的细胞进行8Gy照射后可降低细胞内TP53INP1的表达。结果表明电离辐射后TP53INP1与STAT3之间存在相互作用。结论:1.电离辐射诱导乳腺癌MCF-7细胞发生自噬性死亡。2.TP53INP1参与电离辐射引起的乳腺癌MCF-7细胞自噬。3.TP53INP1可通过STAT3参与电离辐射诱导的乳腺癌MCF-7细胞自噬。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9;R730.55

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