抗APOC3单克隆抗体的制备与双抗体夹心ELISA检测方法的建立

发布时间：2018-03-29 12:36

本文选题：心血管疾病　切入点：脂蛋白代谢　出处：《东北师范大学》2017年硕士论文

【摘要】：载脂蛋白C3(apolipoprotein,APOC3)是在肝内脂蛋白代谢过程中起到重要调节作用的一类含量丰富的脂蛋白转运蛋白。若体内APOC3含量增高,将对脂质代谢造成直接影响,从而引起高甘油三酯血症、冠心病、动脉粥样硬化、代谢综合征等多种疾病的发生。研究表明,APOC3相比于TG是更有效的冠心病预测因子,而且,APOC3可以作为心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)风险的独立预测因子,以APOC3为靶点治疗CVD的研究也已进入临床试验阶段。因此,实时监测APOC3水平并把APOC3作为CVD临床危险因素的新生物标志物,将对心血管疾病的预防与治疗具有重要意义。目前血脂检测的方法比较复杂,APOC3作为新的CVD风险预测因子,急需建立一种快速、准确、简单的检测APOC3的方法。双抗体夹心ELISA具有敏感度高、特异性强、操作简便等特点,且可以进行高通量检测。为了建立APOC3的双抗体夹心ELISA方法,我们首先利用杂交瘤技术制备了APOC3的单克隆抗体,之后建立了APOC3的双抗体夹心ELISA检测方法,具体如下。一、APOC3抗原的制备单克隆抗体是决定双抗体夹心ELISA检测方法特异性和灵敏度的关键,为了制备亲和力高、特异性强的单克隆抗体,我们首先利用前期构建的APOC3原核表达系统,在优化条件下诱导表达出GST-APOC3融合蛋白,并用Western blot进行了鉴定,在分析了GST-APOC3融合蛋白的可溶性后,大量表达了GST-APOC3蛋白,并用GSTrap FF亲和层析柱进行了分离与纯化,之后利用Bradford法对纯化的融合蛋白进行定量。二、利用杂交瘤技术制备APOC3单克隆抗体利用纯化后的GST-APOC3蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后取小鼠血清检测抗体效价,之后对效价最高的小鼠进行加强免疫,免疫后第3天进行了细胞融合。同时对间接ELISA检测体系进行了优化,然后通过间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞并克隆化,最终获得了6株可分泌APOC3单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1B7、2G8、3G10、3E9、3B7和3D9。三、APOC3单克隆抗体的大量制备、纯化及鉴定利用杂交瘤细胞通过体内诱生法制备了小鼠腹水,并对腹水中APOC3单克隆抗体的效价进行了检测。结果显示,6株抗体效价均大于1:1.28×105,其中3B7和3D9抗体的效价可达1:3.125×107以上。之后利用硫酸铵沉淀法对腹水中的抗体进行了纯化,获得了抗APOC3单克隆抗体,利用间接ELISA方法对单克隆抗体的类型进行分析。结果显示,1B7重链为IgG2a,2G8和3B7重链为IgM,3E9、3G10和3D9的重链为IgG1,6株抗体的轻链均为Kappa型。最后,我们又通过间接ELISA和Western blot方法对抗APOC3单克隆抗体的特异性进行了鉴定,证实所制备的单克隆抗体确实能够与APOC3融合蛋白发生特异性反应。四、APOC3双抗体夹心ELISA检测方法的建立利用所制备的单克隆抗体和多克隆抗体建立了APOC3双抗体夹心ELISA检测方法,并对检测体系进行了条件优化,用构建的体系对不同样品进行了检测并与商品化试剂盒检测结果进行了比较,结果表明本研究构建的双抗夹心ELISA检测体系能特异地检测到原核表达的APOC3蛋白,而不能检测到天然的APOC3蛋白。本研究为建立检测APOC3含量的方法提供了有益的借鉴,为以APOC3为目标的CVD血脂分析体系的完善奠定了物质基础。
[Abstract]:In order to establish an apoC3 antibody sandwich ELISA method , we first used hybridoma technique to prepare the monoclonal antibody of APOC3 . Three monoclonal antibodies against APOC3 were identified by indirect ELISA and Western blot .

【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R446.6

【参考文献】