基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量研究

发布时间：2018-06-18 00:44

本文选题：数字PCR + 甲型流感病毒　；参考：《中国疾病预防控制中心》2017年硕士论文

【摘要】：流行性感冒简称流感,是一种重要的呼吸道传染病,可引起严重的疾病负担,造成较高的发病率和死亡率。在临床上,有效地抗病毒治疗可以治疗流感。定量检测流感病毒载量的变化,有助于评价抗病毒治疗的效果,对监测疾病的治疗和转归有很好的指示作用。随着分子生物学技术的发展,核酸定量检测的方法也在不断的更新。目前,核酸定量检测方法主要有依赖核酸序列的扩增技术、分支链DNA信号放大技术、以及普遍应用的实时荧光定量PCR技术等。近几年,新的核酸定量方法--数字PCR技术,也被广泛应用,多用于对样本进行的绝对定量检测,由此给人们提供了新的核酸定量方法。数字PCR技术(DigitalPCR,dPCR),是将标准的PCR反应体系,分配到成千上万个小的PCR反应体系中,尽可能使每个PCR反应孔中含有“1”个或“0”个模板,然后在PCR仪上进行PCR扩增;根据PCR结果中荧光信号的有和无,进行样本拷贝数的统计,最后通过泊松的统计学方法进行处理,从而得到样本中的拷贝数。数字PCR技术,可以进行绝对定量,而不需要建立标准曲线。目前,已有研究利用数字PCR方法对腺病毒、乙型肝炎病毒、HIV病毒等进行绝对定量。针对甲型流感病毒的数字PCR绝对定量方法,还没有系统建立和应用,因此本研究拟建立基于微滴式数字PCR技术的甲型流感病毒绝对定量方法。本研究首先利用微滴式数字PCR定量甲型流感病毒核酸标准品,对退火温度进行了优化,确定了其最佳退火温度为64.4 ℃;利用倍比稀释的核酸标准品,确定了微滴式数字PCR的检测范围至少在四个数量级,方法检测的定量限为23 coPies/μl;微滴式数字PCR的检测定量结果与核酸标准品拷贝数的相关系数为R2=0.9988,表明该方法检测结果具有较高的可信度。用建立好的微滴式数字PCR方法对待检测甲型流感病毒临床样进行了拷贝数定量。因此本研究建立了基于微滴式数字PCR的甲型流感病毒绝对定量方法,可有效地对临床样本中甲型流感病毒载量进行绝对定量,为临床研究中病毒载量的检测提供了一种新的定量技术。通过建立好的微滴式数字PCR检测方法,我们比较了微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR两种方法定量的准确性、灵敏度及检测结果的一致性。利用两种方法同时对甲型流感病毒核酸标准品进行定量,实时荧光定量PCR的方法通过建立标准曲线,计算定量样本的拷贝数,从而和微滴式数字PCR定量的拷贝数直接进行比较。从定量结果可以看出,微滴式数字PCR对核酸标准品定量拷贝数更接近标准品的浓度,定量的浓度高于实时荧光定量PCR的定量结果,准确性更好;对于低浓度的核酸标准品,当实时荧光定量PCR的Ct值为35时(浓度较小的核酸标准品的Ct值均为35)微滴式数字PCR也可以进行定量,其灵敏度略高于实时荧光定量PCR,但两者定量结果没有差异。临床样本的检测结果,经过Bland-Altman分析,两种方法具有很好的定量一致性,两种方法的95%一致性界限 95%(Limit of Agreement(LoA))为-0.2814 至 0.1686;其次对于浓度较高的样本,微滴式数字PCR不能进行定量,超过了其检测范围,需要将样本稀释重新进行定量。综上所述,本研究系统的建立了基于微滴式数字PCR检测甲型流感病毒的绝对定量方法,确定了微滴式数字PCR的检测范围以及定量限。此外,比较了微滴式数字PCR和实时荧光定量PCR的检测一致性,表明微滴式数字PCR可以有效的对临床样本进行定量检测。因此,通过建立该方法可以有效地对甲型流感病毒进行定量,为临床提供了新的定量检测方法,可以更加准确的监测病毒载量的变化,指导临床的药物治疗,监测治疗的效果,对于疾病的转归具有重要的意义。
[Abstract]:A method for absolute quantification of influenza A virus based on microtitre digital PCR has been established . A quantitative analysis of influenza A virus based on micro - drop type digital PCR has been established . The results show that the detection range and the quantification limit of microtitre digital PCR are higher than that of real - time fluorescence quantitative PCR .
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R440;R511.7

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