胍丁胺对脓毒症小鼠血管内皮的保护作用及机制研究
本文关键词：胍丁胺对脓毒症小鼠血管内皮的保护作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的建立盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)模型,探究胍丁胺对脓毒症小鼠血管内皮相关因子及肝、肺组织血管通透性影响,在此基础上进一步探究胍丁胺对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激的人脐带静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分泌功能及通透性的影响,初步探索胍丁胺对内皮细胞相关信号通路的影响,揭示胍丁胺对脓毒症血管内皮的保护作用和相关机制,为临床治疗脓毒症提供新的治疗方案。方法1.动物实验动物实验采用盲肠结扎穿孔术构建脓毒症小鼠模型。将72只8周成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(24只),采用盲肠结扎穿孔术(CLP)构建脓毒症小鼠模型;假手术组只开腹不进行盲肠结扎穿孔术,术后腹腔注射磷酸盐缓冲液。CLP模型组(24只)、胍丁胺(Agmatine,AGM)治疗组(24只),胍丁胺组术后腹腔注射400mg/kg胍丁胺;其余两组术后腹腔注射等量磷酸盐缓冲液,于建模后24h处死小鼠并收集血样,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent Assay,ELISA)检测血清中细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1),血管间粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1),血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),血友病凝血因子(von Willebrand factor,vWF),血管紧张素-2(angiopoietin-2,Ang-2),单核细胞趋化因子(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a,TNF-α),白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6),白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)的含量。通过异硫氰酸荧光素-葡聚糖(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-dextran)荧光示踪的方法检测肝、肺组织血管通透性,苏木素-伊红染色(hematoxylin and eosin,HE)观察肝组织病理学改变。2.细胞实验培养人脐带静脉内皮细胞,实验分为三个组分别为对照组、lps组、agm干预组。通过四甲基偶氮唑溴盐(methylthiazolytetrazolium,mtt)法检测不同浓度lps和agm刺激huvecs后的半数抑制浓度;采用elisa试剂盒检测agm对内皮细胞分泌相关因子的表达作用;在24孔transwell小室(直径6.5mm,孔径0.4μm)内接种1×105个细胞/孔,当细胞成单层细胞层后加脂多糖刺激huvecs,药物作用24h后,加入fitc-葡聚糖,1h后采用荧光酶标仪检测transwell小室上层及下层荧光强度;lps组和agm治疗组分别作用huvecs24h后,提取总蛋白,通过蛋白印迹(westernbolt,wb)实验检测icam-1,内皮素-1(endothelin-1,et-1)的表达;胍丁胺预处理人脐带静脉内皮细胞1h,再用lps刺激内皮细胞15、30、45、60min,提取胞浆、胞核蛋白通过westernbolt检测胍丁胺对内皮细胞核因子-kappab(nuclearfactor-kappab,nf-κb)相关信号通路的影响。结果1.胍丁胺对血清或血浆血管内皮相关因子的作用与假手术组相比,模型组血清和血浆中血管内皮相关生物标志物的含量显著升高icam-1、vcam-1、vegf、vwf、ang-2、mcp-1(p0.01),胍丁胺治疗能明显抑制其含量(p0.01)。同时,与假手术相比,模型组血清炎症因子水平显著升高il-6、il-10、tnf-α(p0.01),而胍丁胺治疗后炎症因子的表达均明显降低(p0.01)。2.胍丁胺对脓毒症小鼠肝、肺组织血管通透性及肝组织病理变化的影响模型组中肝、肺组织荧光强度较假手术组明显增强,而胍丁胺能显著降低肝、肺组织荧光强度(p0.01)。clp建模后24h肝组织有明显病理学改变,细胞充血和炎性细胞浸润,而胍丁胺治疗后明显缓解肝组织的损伤。3.胍丁胺对脂多糖诱导的人脐带静脉内皮细胞的作用lps刺激huvecs后内皮细胞分泌的icam-1、il-6的含量明显增加,胍丁胺作用后内皮细胞分泌的icam-1、il-6显著降低;同时lps作用后transwell小室下室荧光强度明显高于对照组,agm作用后下室荧光强度显著降低(p㩳0.05)4.胍丁胺对LPS刺激后HUVECs蛋白及信号分子的影响LPS组内皮细胞ICAM-1、ET-1蛋白的表达明显高于对照组,胍丁胺组ICAM-1和ET-1蛋白的表达显著低于LPS组。LPS15、30min组内皮细胞核蛋白p65、p50的含量明显高于对照组,胍丁胺15、30min组核蛋白p65、p50含量显著低于LPS组。结论胍丁胺可通过抑制内皮黏附分子、血管内皮生长因子及血友病凝血因子等内皮相关生物标记物和炎症因子的分泌,降低肝、肺组织血管通透性,从而缓解脓毒症小鼠的血管内皮损伤。胍丁胺可改善人脐带静脉内皮细胞分泌功能及通透性,其作用可能是通过介导NF-κB相关信号通路发挥作用。
【关键词】：胍丁胺 脓毒症 盲肠结扎穿刺 内毒素 人脐带静脉内皮细胞
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R459.7
【目录】：
- 摘要5-8
- Abstract8-11
- 前言11-14
- 第一部分 胍丁胺对脓毒症小鼠血管内皮功能的作用14-27
- 1 引言14
- 2 实验材料与方法14-19
- 2.1 实验材料14-15
- 2.2 方法15-19
- 2.3 统计学分析19
- 3 结果19-23
- 3.1 胍丁胺对脓毒症小鼠血清炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α水平的影响19-20
- 3.2 胍丁胺对脓毒症小鼠血清黏附分子ICAM-1、VCAM-1 及MCP-1 水平的影响20
- 3.3 胍丁胺对脓毒症小鼠血浆血管内皮相关因子的影响20-21
- 3.4 胍丁胺对脓毒症小鼠肝血管通透性的影响21
- 3.5 胍丁胺脓毒症肺血管通透性的影响21-22
- 3.6 胍丁胺对脓毒症小鼠肝组织病理学变化的影响22-23
- 4 讨论23-27
- 第二部分 胍丁胺对LPS诱导的人脐带静脉内皮细胞作用及机制研究27-41
- 1 引言27
- 2 实验材料与方法27-33
- 2.1 实验材料27-29
- 2.2 方法29-33
- 2.3 统计学分析33
- 3 结果33-37
- 3.1 LPS、AGM对HUVECs半数抑制浓度33-34
- 3.2 胍丁胺对LPS刺激的HUVECs表达的炎症因子与黏附分子水平的影响34-36
- 3.3 胍丁胺对LPS刺激的HUVECs通透性的作用36
- 3.4 胍丁胺对LPS诱导的HUVECs ICAM-1,ET-1 及，NF-κB蛋白表达的影响36-37
- 4 讨论37-41
- 全文总结41-42
- 参考文献42-45
- 综述 脓毒症血管内皮损伤及调节策略的研究进展45-57
- 参考文献52-57
- 缩略语索引57-59
- 攻读学位期间的研究成果59-60
- 致谢60-61
【参考文献】
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