MiR-346对Graves病小鼠Tfh细胞影响的初步研究

发布时间：2017-03-17 20:01

  本文关键词：MiR-346对Graves病小鼠Tfh细胞影响的初步研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用重组腺病毒载体Ad E-GFP-h TSHR289诱导小鼠GD模型,并初步探讨mi R-346对GD小鼠Tfh细胞的影响。方法:(1)利用电转化的方法将腺病毒骨架质粒转化至E.coli BJ5183中,获得含有腺病毒骨架质粒的E.coli BJ5183(E.coli BJ5183-p),之后将E.coli BJ5183-p制备成化学感受态。(2)利用限制性内切酶技术将h TSHR289插入携带GFP基因的p Ad Track-CMV中,然后将重组后的质粒p Ad Track-h TSHR289转化至感受态E.coli BJ5183-p,利用E.coli BJ5183的重组酶活性,腺病毒骨架质粒和p Ad Track-h TSHR289实现同源重组,得到了携带有目的基因的重组腺病毒骨架质粒(p Ad Easy-GFP-h TSHR289),进一步将此质粒转化至感受态E.coli DH5α中,制备大量拷贝的腺病毒质粒。Pac I酶切p Ad Easy-GFP-h TSHR289,将其转染到人胚肾293A细胞,1-2天后,倒置荧光显微镜下可见293A细胞表达绿色荧光蛋白,初步判断其转染效率。(3)大量扩增重组的腺病毒,TCID50法检测重组腺病毒滴度。在第0、3、6周通过肌肉注射腺病毒免疫刺激雌性BABL/c小鼠。于第10周取小鼠眼球血,ELISA方法检测小鼠血清TRAb和T4水平,同时取甲状腺组织做病理学检查。(4)流式细胞术检测小鼠脾脏和颈部淋巴结Tfh细胞比例。(5)第0、4、8、12、16天,尾静脉注射mi R-346到GD小鼠体内,于第18天处死小鼠,ELISA方法检测小鼠血清TRAb和T4水平,流式细胞术检测小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞的比例,并与对照小鼠进行比较。结果(1)通过酶切,转接和测序验证,得到重组质粒p Ad Easy-GFPh TSHR289,通过人胚肾293A细胞包装得到了重组腺病毒(Ad E-GFPh TSHR289)。(2)重组腺病毒具有高滴度和高感染性,TCID50法测得Ad EGFP-h TSHR289的滴度为3.5×109 pfu/ml,Ad E-GFP-CMV的滴度为2.4×109 pfu/ml;ELISA结果显示,与对照组小鼠相比,腺病毒Ad EGFP-h TSHR289处理组小鼠,80%的血清中TRAb水平明显升高(p0.001),60%的血清T4水平升高(p0.01);甲状腺病理切片显示,实验组小鼠的甲状腺细胞轻度增生,滤泡内胶质明显减少。(3)与对照组小鼠相比,GD小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞的比例是显著增加的(p0.05),而脾脏中则无显著变化。(4)GD小鼠在mi R-346干预后,与对照组相比,小鼠血清中TRAb和T4水平都出现显著性降低(TRAb:p0.05;T4:p0.01)并且小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞的比例也有所下降(p0.05)。结论(1)利用Adeasy系统得到携带h TSHR289的重组腺病毒骨架质粒,通过人胚肾293A细胞包装得到了重组腺病毒。(2)重组腺病毒能够成功诱导BALB/c小鼠GD的发生。(3)GD小鼠颈部淋巴结中Tfh显著增加。(4)mi R-346能够下调Ad E-GFP-h TSHR289诱导的GD小鼠自身抗体的水平。(5)mi R-346能够抑制GD小鼠颈部淋巴结Tfh细胞比例的增多。
【关键词】：miR-346 Graves病 TSHR 腺病毒
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R581;R446
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-16
• 第一章 绪论16-26
• 1.1 Graves病16-17
• 1.1.1 Graves病概述16
• 1.1.2 GD的临床表现和特征16-17
• 1.1.3 GD的发病机制17
• 1.2 TSHR17-20
• 1.2.1 TSHR的基因和蛋白结构18-19
• 1.2.2 TSHR的信号传导19-20
• 1.2.3 TSHR的组织分布20
• 1.3 GD小鼠模型20-22
• 1.3.1 GD的现状20-21
• 1.3.2 GD动物模型的探索21-22
• 1.3.3 理想GD动物模型的构建22
• 1.4 miRNA22-24
• 1.4.1 概述22-23
• 1.4.2 miRNA的生物合成及生物学功能23
• 1.4.3 miRNA与自身免疫病23-24
• 1.5 本研究的目的、方法、实验设计及意义24-26
• 1.5.1 研究目的24
• 1.5.2 研究方法24
• 1.5.3 实验设计24-25
• 1.5.4 意义25-26
• 第二章 人TSHR289基因重组腺病毒的制备与鉴定26-44
• 2.1 实验仪器和材料26-30
• 2.1.1 主要实验仪器26-27
• 2.1.2 菌种、细胞株及质粒27
• 2.1.3 材料和试剂27
• 2.1.4 主要溶液配制27-28
• 2.1.5 相关质粒图谱28-30
• 2.2 实验方法30-37
• 2.2.1 电转化E. coli BJ5183感受态菌制备30-31
• 2.2.2 电转化pAdEasy-131
• 2.2.3 化学法制备感受态E. coli BJ5183-p31-32
• 2.2.4 质粒pBlueScript II SK (+)-hTSHR289扩大培养和鉴定32
• 2.2.5 目的基因hTSHR289的纯化32-33
• 2.2.6 pAdTrack-CMV载体的酶切33
• 2.2.7 目的基因hTSHR289和线性化pAdTrack-CMV载体的连接和鉴定33-34
• 2.2.8 腺病毒载体的重组和鉴定。34-36
• 2.2.9 重组腺病毒载体（pAdEasy-GFP-hTSHR289和pAdEasy-GFP-CMV）的包装。36-37
• 2.3 实验结果37-42
• 2.3.1 pBluescript II SK(+)-hTSHR289的鉴定37-39
• 2.3.2 pAdTrack-hTSHR289的构建和鉴定39-40
• 2.3.3 重组腺病毒质粒载体的构建和鉴定40-41
• 2.3.4 重组腺病毒pAdEasy-GFP-hTSHR289的包装41-42
• 2.4 讨论42-44
• 第三章 GD小鼠模型的构建44-53
• 3.1 实验仪器和材料44-45
• 3.1.1 实验仪器44
• 3.1.2 实验材料44-45
• 3.1.3 实验动物45
• 3.2 实验方法45-48
• 3.2.1 重组腺病毒的大量扩增45-46
• 3.2.2 动物免疫46
• 3.2.3 组织标本及血清的留取46-47
• 3.2.4 血清TRAb检测47-48
• 3.2.5 血清T4检测48
• 3.2.6 小鼠甲状腺组织的病理学检查48
• 3.2.7 统计学分析48
• 3.3 实验结果48-51
• 3.3.1 TCID50法检测病毒滴度48
• 3.3.2 血清TRAb（单位U/L）以及T4检测（单位pg/ml）48-50
• 3.3.3 甲状腺组织病理切片检查50-51
• 3.4 讨论51-53
• 第四章 GD小鼠模型中Tfh细胞比例的变化53-58
• 4.1 实验仪器和材料53-54
• 4.1.1 实验仪器53-54
• 4.1.2 实验材料54
• 4.1.3 实验动物54
• 4.2 实验方法54-55
• 4.2.1 动物模型的构建54
• 4.2.2 流式细胞仪检测小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞比例的变化54-55
• 4.2.3 流式细胞仪检测小鼠脾脏Tfh细胞比例的变化55
• 4.2.4 统计学分析55
• 4.3 实验结果55-57
• 4.3.1 小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞比例的变化55-56
• 4.3.2 小鼠脾脏Tfh细胞比例的变化56-57
• 4.4 讨论57-58
• 第五章 miR-346对GD小鼠模型的影响58-64
• 5.1 实验仪器和材料58-59
• 5.1.1 实验仪器58
• 5.1.2 实验材料58-59
• 5.1.3 实验动物59
• 5.2 miR-346对GD小鼠的影响59-60
• 5.2.1 GD小鼠模型的构建59
• 5.2.2 miR-346对GD小鼠的干预59-60
• 5.2.3 检测血清中TRAb和T4水平60
• 5.2.4 流式细胞仪检测小鼠淋巴结中Tfh细胞60
• 5.2.5 统计学分析60
• 5.3 实验结果60-62
• 5.3.1 miR-346对GD小鼠血清TRAb和T4的影响60-61
• 5.3.2 miR-346对GD小鼠淋巴结中Tfh的影响61-62
• 5.4 讨论62-64
• 结论64-65
• 参考文献65-81
• 致谢81-82
• 攻读硕士期间发表的文章82

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 彭岳;赵铁建;谢海源;韦燕飞;;细胞培养实验中一些细节问题的探讨[J];中华中医药学刊;2009年06期

2 郑丽君;夏文美;童村;;HeLa细胞的培养与使用[J];医药工业;1983年10期

3 李少英;李月秋;朱金玲;;三种细胞生长状况的观察[J];佳木斯医学院学报;1995年06期

4 严国俊;裴燕芳;朱贞宏;吴洁颖;潘金火;;实时细胞电子分析技术的应用研究进展[J];中国药学杂志;2014年03期

5 陈必良,穆润华,马向东,王德堂,辛晓燕,郑维国,严瑞兰;特异性反义寡核苷酸对含HPV16的SiHa细胞的作用[J];第四军医大学学报;2000年03期

6 孟洪弟,戚豫,潘虹,吴希如;无线粒体DNA的ρ°206细胞的培养及其呼吸链功能损害[J];中国优生与遗传杂志;2000年03期

7 何秉燕;邓长生;邹典定;刘湘芬;易有荣;;G-CSF对洛伐他汀诱导的K562细胞内酸碱度及凋亡的影响[J];中华血液学杂志;2006年07期

8 黄静红;李德如;阎国富;;萝卜硫素对HaCaT细胞的影响研究[J];中国美容医学;2010年11期

9 章静波,叶祝三;保护正常组织和细胞——肿瘤化疗研究中的一个动向[J];国外医学参考资料(肿瘤学分册);1978年01期

10 章静波;薛新华;;细胞松弛菌素D对EC_a-109细胞的作用[J];解剖学报;1979年01期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 刘令九;赵小琳;岳立广;徐艳玲;李淑焱;侯丽娟;隋红;姜崴;谢宝生;李勇;刘兵;李海滨;;细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗[A];2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集[C];2011年

2 宋征;;应用Bhas42细胞试验检测22个肿瘤促长基因标志物[A];2013年（第三届）中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年

3 谷彬;张辉;喻泽兰;;依地福新对Jurkat细胞生长抑制机制的研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亚;袁星;;双酚-A对MCF-7细胞伏安行为的影响[A];第五届全国环境化学大会摘要集[C];2009年

5 李晓飞;吕超;吴小荣;韩庆玲;王杰;易宗春;;铅和铝离子对K562细胞红系分化的影响[A];全国生化/工业与卫生毒理学学术会议论文集[C];2010年

6 宋为民;郭波;;复方甘草酸苷对HaCaT细胞表达AQP3的影响[A];2011全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2011年

7 刘鲁明;钱华;陈震;林胜友;黄挺;;参麦注射液对肿瘤细胞环核甘酸的影响[A];全国中医药科研与教学改革研讨会论文集[C];2000年

8 张雪玲;糜漫天;李等松;韦娜;张乾勇;杨志祥;;Lovastatin对HL-60细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达及细胞增殖功能的影响[A];中国营养学会特殊营养第五届学术会议论文摘要汇编[C];2002年

9 房佰俊;廖联明;杨少光;史明霞;赵春华;;胎儿骨髓源原始干细胞分离纯化及其生物学特性的初步研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

10 李晓军;朱传东;汪萍;贾丽;陈芳芳;夏欣一;陈龙邦;;人Id3基因在A549细胞中的表达及对细胞生长功能的研究[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 吴春燕 通讯员 宁习源 吴剑鹏;人类情绪可影响干细胞生长[N];光明日报;2014年

2 冯卫东;老化干细胞可转变成年轻干细胞[N];科技日报;2012年

3 常丽君;科学家阐明核内周期运作机制[N];科技日报;2011年

4 本版编辑邋杜华斌 邰举 毛文波 顾钢 陈超 何屹 毛黎;2007年世界科技发展回顾(六)[N];科技日报;2008年

5 通讯员 李静;厦大教授发现细胞防癌“玄机”[N];厦门日报;2009年

6 永诚;美发现控制细胞生长的蛋白质[N];中国医药报;2000年

7 记者 张孟军;加找到刺激干细胞生长分子[N];科技日报;2001年

8 张田勘;干细胞研究精彩纷呈[N];中国医药报;2011年

9 邵薇/编译;T细胞的非凡能力[N];北京科技报;2003年

10 经天;控制细胞生长的蛋白质[N];中药事业报;2000年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 蒋渊;缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制的研究[D];第三军医大学;2015年

2 张广;肝星状细胞在肝癌细胞恶性行为中的作用及机制研究[D];南京医科大学;2015年

3 杨小超;阳离子配体修饰的纳米金用于细胞转运和微囊自组装研究[D];重庆大学;2010年

4 叶玲玲;基于生物素诱导表达系统的HEK293细胞多基因代谢工程改造[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

5 梁国斌;产朊假丝酵母生产谷胱甘肽过程控制与优化[D];江南大学;2008年

6 杨海虹;钙池操纵性钙内流在人肺腺癌A549细胞中的研究[D];南方医科大学;2012年

7 常玉娟;基于Nrf2/ARE通路辛开苦降方胃康宁对人胃粘膜上皮细胞SOD2、GSTP1相关调控机制的研究[D];北京中医药大学;2015年

8 杨丽君;人Fcα/μR的表达与功能的初步研究[D];中国协和医科大学;2008年

9 李曼;DRC3f及eRF3b在肝病发生发展中作用机制的初步研究[D];河北医科大学;2011年

10 王永军;凋亡/增殖平衡失调在肺癌发生中作用的研究[D];中国协和医科大学;1997年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 柯自立;硫酸镁对6-羟基多巴胺损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用[D];福建医科大学;2015年

2 李婷婷;细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究[D];川北医学院;2015年

3 王静;环氧化物酶抑制剂NS-398联合奥沙利铂对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响[D];河北医科大学;2015年

4 郑禄禄;番茄红素对转染SOD1-G93A的PC12细胞线粒体的保护作用[D];河北医科大学;2015年

5 宋晨源;氯化铵对人正常肝细胞系changliver中二氢乳清酸脱氢酶表达的影响[D];郑州大学;2015年

6 张莉;白藜芦醇体外抑制肠道病毒71型的作用机制研究[D];苏州大学;2015年

7 高华武;富硒芪云抗肿瘤作用及其机制的实验研究[D];安徽中医药大学;2015年

8 宋加奎;丹参对人胃癌SGC-7901细胞化疗敏感性的影响[D];安徽中医药大学;2015年

9 许雅鑫;尼古丁对NCI-H1975和NCI-H460细胞促进增殖作用及对PI3K/Akt通路的影响研究[D];山西医科大学;2015年

10 高娜;加减驻景方含药血清对二氯化钴诱导后ARPE-19细胞表达VEGF及HIF-1α的影响[D];青海大学;2015年

  本文关键词：MiR-346对Graves病小鼠Tfh细胞影响的初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：253350