高脂肥胖对肠道微生态、短链脂肪酸的影响

发布时间：2017-03-18 02:05

  本文关键词：高脂肥胖对肠道微生态、短链脂肪酸的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:肠道作为机体最大的消化器官,其中定居着大量的微生物群落,参与对物质的消化与吸收,并且其发酵的代谢产物短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)在维持肠道健康和正常功能的行驶方面起着至关重要的作用。肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)为肠道的第一道保护屏障,与肠道内环境直接接触。本实验研究了在肥胖情况下肠道中微生物群落及其代谢产物SCFAs的变化情况,并探讨这种变化因素对肠上皮细胞的影响。方法:(1)为研究肥胖情况下,肠道中微生物群落的变化情况,将适龄C57BL/6小鼠分为肥胖组(HFD)与正常组(LFD,6周后,分别取其肠道内容物。通过Miseq高通量测序技术分别对肠道中微生物群落进行检测和鉴定,确定肠道微生态的变化。(2)为建立快速检测粪便中SCFAs的方法,并确定此种检测结果的稳定性。分别取不同种属来源的粪便,气相色谱-质谱联用(Gas chromatography mass spectrometry,GC-MS)方法分别检测粪便中SCFAs,探究在生理状态下,粪便中SCFAs的存在形式,并确定GC-MS方法的可行性和稳定性。(3)取上述肥胖小鼠及正常对照小鼠结肠内容物,通过GC-MS的方法测定其中SCFAs的含量,探究在肥胖情况下,粪便中SCFAs的变化趋势。(4)为研究在肠道疾病如肠炎情况下,粪便中SCFAs的存在方式,将适龄C57BL/6小鼠分为肠炎组(DSS)和正常组(NC),7天后,分别取其肠道内容物,GC-MS测定粪便中SCFAs含量,确定在肠炎状态下,粪便中SCFAs的变化情况。(5)体外试验中,为研究丁酸对肠上皮细胞的影响,将肠上皮细胞SW48细分为6中处理组,分别为正常组(NC)、LPS处理组(LPS)、丁酸处组(BU)、丁酸-LPS共同处理组(BU+LPS)、TSA处理组(TSA)、TSA-LPS共同处理组(TSA+LPS),观察丁酸、TSA对细胞生长状态的影响,通过CCK-8探究细胞的增殖能力,并通过流式、western blot及定量测定其细胞表面TLR4的表达情况,再以不同浓度丁酸和TSA处理细胞,确定不同浓度下的丁酸及TSA对细胞表面TLR4表达的影响。为确定丁酸对TLR4下游信号通路的影响,western blot检测上述6种处理组中下游信号通路中各种信号分子的表达情况。结果:(1)通过Miseq测序技术检测细菌16s r RNA结果发现,与正常对照组相比较,肥胖小鼠肠道中微生物丰富度及多样性下降并且S24-7及拟杆状菌属数量明显减少,但脱硫弧菌属增多。(2)GC-MS检测正常C57BL/6小鼠结肠内容物及新鲜粪便、SD大鼠粪便及健康成人粪便中SCFAs结果发现,在正常情况下,粪便中SCFAs以乙酸、丙酸、丁酸及戊酸为主,就其含量而言,乙酸含量最多,丁酸、丙酸次之,戊酸含量相对较低,并且在不同的哺乳动物粪便中,各种SCFAs有相似的存在形式。(3)通过GC-MS对肥胖小鼠粪便中SCFAs检测发现,在肥胖情况下,各种SCFAs都有不同程度的下降,其中丁酸下降较为明显。(4)肥胖为诱发肠炎的一个影响因素,通过GC-MS测定肠炎小鼠粪便中SCF As的变化情况,结果表明,在肠炎情况下,粪便中SCFAs的变化与在肥胖情况下的变化趋势相似,除乙酸外的丙酸、丁酸及戊酸含量都发生了明显的下降,其中以丁酸含量下降尤为明显。(5)体外实验中,以丁酸及TSA处理肠上皮细胞发现,丁酸及TSA处理后的细胞生长状态较差并且对细胞增殖起抑制作用,这种抑制作用具有浓度依赖效应。流式、western blot及定量检测细胞表面TLR4发现,丁酸及TSA处理后会上调细胞表面TLR4的表达,而降低处理浓度后这种上调作用依然存在。结论:(1)通过Miseq高通量测序技术对肠道内微生物群落的检测及鉴定发现,当肥胖发生时,肠道内微生态,与正常情况比较,发生了明显的变化。(2)GC-MS可快速检测粪便中的SCFAs,并有可能应用于临床等肠道疾病的辅助诊断。(3)在肥胖及肠炎等疾病状态下,粪便中各种SCFAs含量都发生了明显的下降。(4)丁酸可上调细胞表面TLR4的表达,并调节细胞下游信号的转导。
【关键词】：短链脂肪酸(short-chain fatty acids SCFAs) 粪便 气相色谱-质谱联用(Gas chromatography mass spectrometry GC-MS) Miseq高通量测序 肠道微生态 肠上皮细胞(intestinal epithelial cells IECs)
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R589.2;R446.1
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第一章 绪论14-24
• 1.1 肠道微生态与疾病14-16
• 1.1.1 肠道微生物群落多样性分析14-15
• 1.1.2 肠道微生态与疾病15
• 1.1.3 肠道微生态与肥胖15-16
• 1.2 短链脂肪酸及其作用机制16-19
• 1.2.1 SCFAs的吸收与代谢16-17
• 1.2.2 SCFAs与肠道疾病17
• 1.2.3 SCFAs的作用机制17-19
• 1.3 肠上皮细胞与肠道疾病19
• 1.4 气相色谱质谱联用原理及应用19-21
• 1.4.1 气相色谱质谱联用原理19-20
• 1.4.2 GC-MS方法的应用20-21
• 1.5 本实验研究目的、实验设计、实验方法及研究意义21-24
• 1.5.1 研究目的21
• 1.5.2 实验设计21-22
• 1.5.3 实验方法22-23
• 1.5.4 研究意义23-24
• 第二章 肠道中微生物群落多样性分析24-32
• 2.1 实验动物24
• 2.2 实验材料24
• 2.3 肥胖小鼠模型的建立24
• 2.4 检测方法24-25
• 2.4.1 Miseq测序流程25
• 2.4.2 测序数据分析25
• 2.5 结果25-31
• 2.5.1 肥胖小鼠及正常对照小鼠粪便中微生物序列OTU聚类分析25-26
• 2.5.2 肥胖小鼠及正常对照小鼠粪便中微生物丰度及多样性分析26-29
• 2.5.3 肥胖小鼠及正常对照小鼠肠道中微生物群落结构组分分析29-31
• 2.6 讨论31-32
• 第三章 建立气相色谱质谱联用检测粪便中短链脂肪酸的方法32-43
• 3.1 实验动物32
• 3.2 肥胖小鼠模型的建立32
• 3.3 肠炎小鼠模型的建立32-33
• 3.4 实验材料33-34
• 3.4.1 主要实验试剂及材料33-34
• 3.4.2 实验仪器34
• 3.5 实验方法34-36
• 3.5.1 粪便及肠内容物的采集34
• 3.5.2 粪便样本的处理34-35
• 3.5.3 仪器的测定35
• 3.5.4 小鼠肠组织荧光定量PCR35-36
• 3.6 结果36-41
• 3.6.1 GC-MS测定正常生理状态下粪便中的SCFAs36-38
• 3.6.2 GC-MS测定肥胖及疾病情况下肠道粪便中SCFAs38-41
• 3.7 讨论41-43
• 第四章 丁酸对肠上皮细胞表面TLR4表达的影响43-57
• 4.1 研究对象43
• 4.2 实验材料43-45
• 4.2.1 实验试剂43-44
• 4.2.2 实验仪器44-45
• 4.3 实验方法45-48
• 4.3.1 CCK-8 测定细胞增殖实验45
• 4.3.2 荧光定量PCR45-46
• 4.3.3 流式细胞术-第一通道（细胞表面标记）46
• 4.3.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE（Western Blot）46-48
• 4.4 结果48-55
• 4.4.1 丁酸对肠上皮细胞生物学行为的影响48-50
• 4.4.2 丁酸上调细胞表面TLR4受体的表达50-55
• 4.5 讨论55-57
• 第五章 主要结论和展望57-58
• 5.1 主要结论57
• 5.2 展望57-58
• 参考文献58-65
• 第六章 文献综述 短链脂肪酸生理作用作用的研究65-71
• 参考文献69-71
• 致谢71-72
• 攻读硕士学位期间发表的文章72

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本文编号：253773